本发明涉及生物医药。具体地说是一种具有脑卒中治疗特性的复合物及其制备方法与应用。
背景技术：
1、脑卒中是一种急性脑血管疾病，具有高发病率、高致残率和高死亡率的特点，给社会和家庭带来了沉重的负担。目前，脑卒中的治疗主要依赖于溶栓治疗、抗血小板治疗以及神经保护治疗等手段，但这些方法均存在一定的局限性。例如，溶栓治疗受限于治疗时间窗窄、出血风险高等问题；抗血小板治疗则可能引发出血、胃肠道不适等副作用；而现有的神经保护药物疗效有限，难以满足临床需求。
2、近年来，随着生物技术的不断发展，科研人员开始探索利用多肽、纳米酶等新型生物分子作为治疗脑卒中的潜在药物。例如，昆明动物研究所赖仞研究员带领的学科组与多伦多大学倪合宇教授等人合作，从森林山蛭中鉴定出一个具有显著治疗作用的活性多肽。该多肽能够专一性抑制激肽释放酶和十二因子的活性，对短暂性缺血性脑卒中和永久性缺血性脑卒中均表现出良好的治疗效果，且具有良好的生物安全性和抗血栓形成作用，而且也没有出血风险，具备显著的候选药物开发特征。
3、然而，该多肽需要从森林山蛭中取得，生产较为不便，且成本较高。因此，有必要进一步研发新型、高效、安全且成本相对低廉的对脑卒中具有治疗效果的多肽，以满足临床需求。
技术实现思路
1、为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种高效、安全且经济的具有脑卒中治疗特性的复合物及其制备方法与应用。该复合物制备方法简单，成本低廉，且具有良好的治疗效果和生物安全性。
2、为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
3、一种具有脑卒中治疗特性的复合物，所述复合物含有酵母肽和羟基酪醇；所述酵母肽为木瓜蛋白酶酶解酵母蛋白产生的分子质量大于或等于1kda且小于3kda的酵母肽；所述木瓜蛋白酶酶解酵母蛋白时的ph为6.8～7.2，酶解时间为3.8～4.2h，酶解温度为48～52℃，酶解体系中木瓜蛋白酶与酵母蛋白的酶量/质量比为8800～9200u/g。实验证明，采用该方法制备的酵母肽具有一定的缓解小鼠脑卒中的作用，且该酵母肽与羟基酪醇形成的复合物在小鼠实验中也表现出了对缓解脑卒中、逆转缺血再灌注时的氧化损伤的作用。
4、上述的具有脑卒中治疗特性的复合物，所述复合物还含有卵磷脂和/或利用卵磷脂制备得到的磷脂膜；所述磷脂膜的制备方法为，将卵磷脂溶于三氯甲烷后挥干三氯甲烷。在复合物中引入卵磷脂或磷脂膜，可以促进酵母肽和羟基酪醇的结合。
5、上述的具有脑卒中治疗特性的复合物，当复合物中加入卵磷脂时：酵母肽、羟基酪醇和卵磷脂三者的物质的量之比为(6.5～38.9)：(6.5～38.9)：(0.1～0.5)；当复合物中加入磷脂膜时，磷脂膜的量按照制备磷脂膜所用卵磷脂的物质的量计算：酵母肽、羟基酪醇和磷脂膜三者的物质的量之比为(6.5～38.9)：(6.5～38.9)：(0.1～0.5)。
6、上述的具有脑卒中治疗特性的复合物的制备方法，包括以下步骤：
7、(1)将酵母制成的酵母蛋白粉配制成酵母蛋白粉分散液；
8、(2)将酵母蛋白粉分散液置于酶解反应温度下振荡；
9、(3)向酵母蛋白粉分散液中加入木瓜蛋白酶以进行酶解，酶解结束后得到酶解液；
10、(4)加热酶解液至蛋白酶钝化温度并保温，而后冷却酶解液并调节酶解液的ph；
11、(5)对酶解液离心并取上清，对上清依次进行超滤和冷冻干燥，得到分子质量大于或等于1kda且小于3kda的酵母肽；
12、(6)将酵母肽和羟基酪醇分散于磷酸盐缓冲液中制成复合体系，搅拌，得到酵母肽-羟基酪醇复合物分散液；
13、(7)对酵母肽-羟基酪醇复合物分散液进行纯化和冷冻干燥，得到酵母肽-羟基酪醇复合物，所述酵母肽-羟基酪醇复合物即为上述的具有脑卒中治疗特性的复合物。
14、上述的具有脑卒中治疗特性的复合物的制备方法，在步骤(1)中，使用磷酸盐缓冲液配制酵母蛋白粉分散液，磷酸盐缓冲液的ph等于酶解时的ph；所述酵母蛋白粉中酵母蛋白的含量大于或等于80wt％，所述酵母蛋白粉分散液中，酵母蛋白粉的浓度为48～50g/l。
15、上述的具有脑卒中治疗特性的复合物的制备方法，在步骤(2)中，振荡时间为10～15min；在步骤(4)中，蛋白酶钝化温度为95～100℃，保温时间为10～15min；酶解液自然冷却后，将酶解液的ph调节至7.0。
16、上述的具有脑卒中治疗特性的复合物的制备方法，在步骤(5)中，对酶解液进行离心时，离心温度为4～8℃，离心时的转速为10000～12000rpm，离心时间为10～20min；
17、在步骤(6)中，所述复合体系中酵母肽与羟基酪醇的物质的量之比为1:1，所述复合体系中羟基酪醇的浓度为1～6mg/ml；制得所述复合体系后，向所述复合体系中加入卵磷脂和/或利用卵磷脂制成的磷脂膜；所述复合体系中的磷脂膜的量按照卵磷脂的物质的量计算，卵磷脂在复合体系中的物质的量浓度为0.1～0.5mmo l/l。
18、上述的具有脑卒中治疗特性的复合物的制备方法，在步骤(6)中，搅拌过程中，对所述复合体系进行循环加热；所述循环加热的方法为，以3～7℃/min的升温速率将复合体系加热至48～52℃，保温20～30min，而后自然冷却至室温，直至搅拌结束；搅拌时间为20～26h。
19、上述的具有脑卒中治疗特性的复合物的制备方法，在步骤(1)中，使用磷酸盐缓冲液配制酵母蛋白粉分散液，磷酸盐缓冲液的ph为7.0；所述酵母蛋白粉中的酵母蛋白含量大于或等于80wt％，所述酵母蛋白粉分散液中，酵母蛋白粉的浓度为50g/l；
20、在步骤(2)中，振荡时间为10min；
21、在步骤(3)中，酶解时间为4h，酶解温度为50℃，酶解时的ph为7，酶解体系中木瓜蛋白酶与酵母蛋白的酶量/质量比为9000u/g；
22、在步骤(4)中，蛋白酶钝化温度为100℃，保温时间为10min；酶解液自然冷却后，将酶解液的ph调节至7.0；
23、在步骤(5)中，对酶解液进行离心时，离心温度为4℃，离心时的转速为10000rpm，离心时间为15min；
24、在步骤(6)中，复合体系中酵母肽与羟基酪醇的物质的量之比为1:1，所述复合体系中羟基酪醇的浓度为5mg/ml；制得所述复合体系后，向所述复合体系中加入卵磷脂和/或利用卵磷脂制成的磷脂膜；所述复合体系中的磷脂膜的量按照卵磷脂的物质的量计算，卵磷脂在复合体系中的物质的量浓度为0.1mmo l/l；搅拌过程中，对所述复合体系进行循环加热；所述循环加热的方法为，以5℃/min的升温速率将复合体系加热至50℃，保温30min，而后自然冷却至室温，直至搅拌结束；搅拌时间为24h。酵母肽和羟基酪醇按照1:1的物质的量之比复合时，酵母肽和羟基酪醇之间的接触和结合较为高效。循环加热可以促进酵母肽与羟基酪醇的充分接触和结合，提高复合物的形成效率。对温度的控制有助于提高复合物的稳定性，避免高温导致的组分降解或失活，从而增强复合物的疗效。
25、上述的具有脑卒中治疗特性的复合物的应用，所述复合物用于制造治疗缺血性脑卒中的药物。
26、本发明的技术方案取得了如下有益的技术效果：
27、1、本发明提供一种具有脑卒中治疗特性的复合物。该复合物由酵母肽和羟基酪醇复合制得，对缺血性脑卒中表现出了明显的治疗特性。动物实验结果表明，注射该酵母肽-羟基酪醇复合物的小鼠的脑梗死面积显著下降，神经学评分也明显降低；该酵母肽-羟基酪醇复合物能够减少小鼠脑组织中的活性氧簇含量、提升超氧化物歧化酶活性、提升抗氧化物质谷胱甘肽含量，逆转缺血再灌注时的氧化损伤，无明显的毒副作用。该复合物有望成为治疗脑卒中的新型药物，为临床提供一种更为安全、有效的治疗手段。
28、2、本发明的复合物采用木瓜蛋白酶酶解酵母蛋白制备，工艺简单，原料易得，生产成本低廉。相比于一些需要从特殊生物中提取的多肽药物，本发明的复合物更具经济性和可行性。
1.一种具有脑卒中治疗特性的复合物，其特征在于，所述复合物含有酵母肽和羟基酪醇；所述酵母肽为木瓜蛋白酶酶解酵母蛋白产生的分子质量大于或等于1kda且小于3kda的酵母肽；所述木瓜蛋白酶酶解酵母蛋白时的ph为6.8～7.2，酶解时间为3.8～4.2h，酶解温度为48～52℃，酶解体系中木瓜蛋白酶与酵母蛋白的酶量/质量比为8800～9200u/g。
2.根据权利要求1所述的具有脑卒中治疗特性的复合物，其特征在于，所述复合物还含有卵磷脂和/或利用卵磷脂制备得到的磷脂膜；所述磷脂膜的制备方法为，将卵磷脂溶于三氯甲烷后挥干三氯甲烷。
3.根据权利要求2所述的具有脑卒中治疗特性的复合物，其特征在于，当复合物中加入卵磷脂时：酵母肽、羟基酪醇和卵磷脂三者的物质的量之比为(6.5～38.9)：(6.5～38.9)：(0.1～0.5)；当复合物中加入磷脂膜时，磷脂膜的量按照制备磷脂膜所用卵磷脂的物质的量计算：酵母肽、羟基酪醇和磷脂膜三者的物质的量之比为(6.5～38.9)：(6.5～38.9)：(0.1～0.5)。
4.具有脑卒中治疗特性的复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的具有脑卒中治疗特性的复合物的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，使用磷酸盐缓冲液配制酵母蛋白粉分散液，磷酸盐缓冲液的ph等于酶解时的ph；所述酵母蛋白粉中酵母蛋白的含量大于或等于80wt％，所述酵母蛋白粉分散液中，酵母蛋白粉的浓度为48～50g/l。
6.根据权利要求4所述的具有脑卒中治疗特性的复合物的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，振荡时间为10～15min；在步骤(4)中，蛋白酶钝化温度为95～100℃，保温时间为10～15min；酶解液自然冷却后，将酶解液的ph调节至7.0。
7.根据权利要求4所述的具有脑卒中治疗特性的复合物的制备方法，其特征在于，在步骤(5)中，对酶解液进行离心时，离心温度为4～8℃，离心时的转速为10000～12000rpm，离心时间为10～20min；
8.根据权利要求4所述的具有脑卒中治疗特性的复合物的制备方法，其特征在于，在步骤(6)中，搅拌过程中，对所述复合体系进行循环加热；所述循环加热的方法为，以3～7℃/min的升温速率将复合体系加热至48～52℃，保温20～30min，而后自然冷却至室温，直至搅拌结束；搅拌时间为20～26h。
9.根据权利要求4所述的具有脑卒中治疗特性的复合物的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，使用磷酸盐缓冲液配制酵母蛋白粉分散液，磷酸盐缓冲液的ph为7.0；所述酵母蛋白粉中的酵母蛋白含量大于或等于80wt％，所述酵母蛋白粉分散液中，酵母蛋白粉的浓度为50g/l；
10.如权利要求1-3任一所述的具有脑卒中治疗特性的复合物的应用，其特征在于，所述复合物用于制造治疗缺血性脑卒中的药物。
