本发明涉及的是一种基因工程领域的技术，具体是一种细菌纳米纤维素胞内合成的优化实现方法。
背景技术：
1、细菌纳米纤维素(bacterial nano-cellulose,bc)是一种由微生物合成的胞外不可溶性多糖，由微生物胞内的bc合成酶(bcsa、bcsb、bcsc、bcsd)和一些辅助蛋白(bcsh、cmcax、bglx)调控其聚合、分泌、组装和结晶过程。木葡糖酸醋杆菌(komagataeibacterxylinus)是目前研究最多且其bc合成能力最强的微生物，属于严格好氧菌。在发酵培养基中，k.xylinus合成的bc会交错缠绕，将细胞包裹在纤维网络中，导致菌体生长缓慢并逐渐衰亡，这样的发酵特性严重影响了细菌生长和产物bc的合成，存在bc生产量及其效率低的问题。另外，目前的bc提纯方式主要是通过去离子水多次清洗去除杂质，再采用0.05-0.25m的碱性溶液高温浸泡去除菌体。然而，在碱性溶液中，bc末端的葡萄糖基会被裂解；如在高温条件下则会发生碱性水解反应，进一步破坏多糖结构，造成其聚合度下降。
技术实现思路
1、本发明针对现有技术胞外生产bc包裹缠绕菌体而导致生产周期长和生产效率低的问题，提出一种细菌纳米纤维素胞内合成的优化实现方法，包括bc分泌相关基因的敲除和合成相关基因的过表达，避免了bc分泌到胞外之后、细胞生长受阻且产量提升受限这样的困境，解决了胞外生产bc包裹缠绕菌体而导致生产效率低的问题。另外，在动态发酵结束后、可采用简便的胞内bc的溶剂提纯方法，避免了bc结构性质被使用碱煮条件而被破坏，故本方法是一种新的高效生产bc的方式。
2、本发明是通过以下技术方案实现的：
3、本发明涉及一种用于生产胞内细菌纳米纤维素的木葡糖酸醋杆菌△acsc_132+bglb_2，分类命名：komagataeibacterxylinus，保藏编号为cgmcc no.31120，现保藏于中国科学院微生物研究所(北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏日期2024年7月1日。
4、所述的木葡糖酸醋杆菌△acsc_132+bglb_2不再分泌bc到胞外，且与出发菌株木葡糖酸醋杆菌(k.xylinusatcc 53524)相比，细胞生长量显著提高。
5、所述的细胞生长量，通过以下方法测定：
6、1)采用比浊法测定△acsc_132+bglb_2的细胞生长量，取发酵液稀释合适倍数后，利用分光光度计测定细菌悬液的光密度od600并制作生长曲线。
7、2)先采用纤维素酶酶解k.xylinusatcc 53524菌株合成的胞外bc，再采用比浊法测定其细胞生长量。准确称取21.01g的一水合柠檬酸和29.41g的柠檬酸钠，分别定容至1l蒸馏水中；取0.1mol/l的柠檬酸溶液828ml和0.1mol/l的柠檬酸钠溶液972ml，混合均匀，配成ph＝4.8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液；取18g纤维素酶(麦克林，10000u/g)溶于1.8l的缓冲液中，利用0.22μm过滤膜进行抽滤，去除纤维素酶中的不溶物质，配成100u/ml的纤维素酶溶液；向含有50ml发酵液的250ml锥形瓶中加入50ml纤维素酶液，使得最终纤维素酶浓度为50u/ml，55℃，180rpm酶解12-24h；对于酶解不充分的发酵液，3000g离心10min，向沉淀中加入25ml的纤维素酶液和25ml的蒸馏水，55℃，180rpm继续酶解，显微镜观察直至bc酶解完全，测定od600并制作生长曲线。
8、本发明涉及上述木葡糖酸醋杆菌△acsc_132+bglb_2的实现方法，以木葡糖酸醋杆菌(k.xylinusatcc 53524)为出发菌株，敲除与bc分泌可能相关的acsc_1、acsc_2和acsc_3基因后构建得到了一株生产胞内bc的△acsc_132菌株；再在△acsc_132基础上，过表达bglb_2基因后构建得到，具体包括：
9、步骤一、构建k.xylinus基因敲除工程菌△acsc_132：
10、1.1)构建包含acsc_1基因上下游同源臂和氯霉素抗性基因的敲除片段△acsc_1-c，并制备k.xylinusatcc 53524电转感受态细胞；将敲除片段电转入感受态细胞并测序验证，获得acsc_1单基因敲除的k.xylinus工程菌△acsc_1。
11、1.2)构建包含acsc_3基因上下游同源臂和氨苄青霉素抗性基因的敲除片段△acsc_3-a，并制备△acsc_1-c电转感受态细胞；将敲除片段电转入感受态细胞并测序验证，获得acsc_1和acsc_3双基因敲除的工程菌△acsc_13。
12、1.3)构建包含acsc_2基因上下游同源臂和卡那霉素抗性基因的敲除片段△acsc_2-k，并制备△acsc_13电转感受态细胞；将敲除片段电转入感受态细胞并测序验证，获得acsc_1、acsc_3和acsc_2三基因敲除的工程菌株，即△acsc_132。
13、步骤二、构建k.xylinus基因过表达工程菌△acsc_132+bglb_2：
14、2.1)构建辅助质粒p331-pj23104、p331-amp和p331-spc，其中p331-spc质粒以壮观霉素抗性为选择标记，其启动子、rbs和终止子分别为pj23104、bba_b0034和lambdat0。
15、2.2)以k.xylinusatcc 53524的基因组为模板，pcr扩增得到bglb_2基因片段；以p331-spc质粒为模板，pcr扩增得到质粒载体片段；通过pcr一步定向克隆试剂盒完成过表达质粒p331-bglb_2的构建。
16、2.3)制备△acsc_132电转感受态细胞，将过表达质粒电转入感受态细胞并测序验证，获得bglb_2基因过表达的工程菌△acsc_132+bglb_2。
17、所述的acsc_1基因的核苷酸序列如序列表seq id no.1所示，acsc_2基因的核苷酸序列如序列表seq id no.2所示，acsc_3基因的核苷酸序列如序列表seq id no.3所示，bglb_2基因的核苷酸序列如序列表seq id no.4所示。
18、所述的敲除片段和过表达质粒中的抗生素抗性基因为氨苄青霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因和壮观霉素抗性基因。
19、本发明涉及一种基于上述木葡糖酸醋杆菌△acsc_132+bglb_2的应用，通过将该菌株动态发酵后实现，胞内bc产量得到显著提高。
20、所述的动态发酵，通过以下方法进行：
21、1)菌株活化：将-80℃冻存的对照菌和工程菌划线至含有相应抗性的hs固体平板上，30℃培养1-2天。
22、2)种子培养：从平板上刮取一环菌落至装有30ml hs液体培养基(添加相应抗性，k.xylinusatcc 53524需额外添加5u/ml纤维素酶)的250ml锥形瓶中，30℃，180rpm过夜培养。
23、3)动态发酵：测定种子菌体量od600，按照初始od600为0.04的接种量(k.xylinusatcc 53524种子液需3000g离心10min去除含纤维素酶的培养基)，接至装有50ml hs液体培养基的250ml发酵瓶中，30℃，180rpm培养2-5天。
24、所述的胞内bc，通过以下方法进行提纯和测定：
25、1)菌体收集：测定工程菌发酵2-5天的od600，取od＝20-50的菌量至15ml离心管中，6000g离心10min。
26、2)破碎细胞并去除可溶性糖：向15ml离心管中，加入5ml 80％乙醇溶液，100℃，水浴15-30min，6000g离心10min；去上清，向沉淀中再加入5ml 80％乙醇溶液，重复水浴2-3次，6000g离心10min，去除细胞内可溶性的还原糖和多糖，收集沉淀。
27、3)去除蛋白：将沉淀转移至1.5ml离心管中，用蒸馏水清洗3次，6000g离心10min，去除残留乙醇；取2g蛋白酶粉末，定容至100ml蒸馏水中，配置20mg/ml的蛋白酶液；向沉淀中加入1ml配置好的蛋白酶液，55℃孵育1-5h，6000g离心10min，去除蛋白，收集沉淀。
28、4)去除脂质：向沉淀中加入1ml氯仿-甲醇(v/v＝1:1)，在振荡器上1000rpm振荡15-30min；6000g离心10min，于沉淀中加入1ml甲醇洗1次，1ml丙酮洗1次，1ml蒸馏水洗2-3次，6000g离心10min，去除脂质，沉淀用于胞内bc含量测定。
29、5)胞内bc含量测定：向沉淀中加入0.5ml的蒸馏水，置于冰水混合物中，并缓慢加入0.75ml浓硫酸，混匀后冰水浴静置30min；8000g，4℃离心10min，取上清液稀释合适倍数待测；配置浓度分别为0.005、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1mg/ml的葡萄糖标准溶液和0.2％的蒽酮试剂(2g蒽酮溶解于100ml浓硫酸)；分别取200μl葡萄糖标准溶液、蒸馏水和样品上清液至1.5ml离心管中；加入400μl蒽酮试剂，混匀后置于沸水浴中10min，取出后冷却至室温，吸取200μl于96孔板，用酶标仪测定620nm处的吸光值；根据标准品的浓度(x,mg/ml)和吸光度(y,△a)绘制标准曲线，并计算样品的浓度(x,mg/ml)，单位细胞干重的bc含量(mg/gdcw)＝x×1.25÷1.11÷m。其中，纤维素提取液体积为1.25ml(0.5ml蒸馏水+0.75ml浓硫酸)，葡萄糖含量换算为纤维素含量常数为1.11(111μg葡萄糖用蒽酮试剂显色相当于100μg纤维素)，m为量取的od＝20-50的细胞干重。
1.一种用于生产胞内细菌纳米纤维素的工程菌，其特征在于，具体为：木葡糖酸醋杆菌(komagataeibacter xylinus)△acsc_132+bglb_2，保藏编号为cgmcc no.31120，现保藏于中国科学院微生物研究所，保藏日期2024年7月1日；
2.一种权利要求1所述木葡糖酸醋杆菌△acsc_132+bglb_2的实现方法，其特征在于，以木葡糖酸醋杆菌(k.xylinus atcc 53524)为出发菌株，敲除acsc_1、acsc_2和acsc_3基因后构建得到△acsc_132菌株；再在△acsc_132基础上，过表达bglb_2基因后构建得到。
3.根据权利要求2所述的实现方法，其特征是，具体包括：
4.根据权利要求2或3所述的实现方法，其特征是，所述的acsc_1基因的核苷酸序列如序列表seq id no.1所示，acsc_2基因的核苷酸序列如序列表seq id no.2所示，acsc_3基因的核苷酸序列如序列表seq id no.3所示，bglb_2基因的核苷酸序列如序列表seq idno.4所示。
5.根据权利要求2或3所述的实现方法，其特征是，所述的敲除片段和过表达质粒中的抗生素抗性基因为氨苄青霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因和壮观霉素抗性基因。
6.一种基于权利要求1或权利要求2-5所述方法制备得到的木葡糖酸醋杆菌△acsc_132+bglb_2的应用，其特征在于，通过将该菌株动态发酵后实现。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征是，所述的动态发酵，通过以下方法进行：
8.根据权利要求7所述的应用，其特征是，所述的胞内bc，通过以下方法进行提纯和测定：
