【】本发明涉及酶制剂应用，特别涉及一种水牛初乳源活性肽调制乳及发酵乳的制备方法。
背景技术
0、
背景技术：
1、水牛乳是世界第二大乳，其产量约占全球乳产量的13％，并且中国是水牛乳产量大国。我国水牛乳与其他哺乳动物的乳相比，蛋白含量高达4.3％，水牛初乳甚至达到10％，乳清蛋白是乳品工业的主要产品之一，其含量占水牛初乳的80％左右，但随泌乳时间延长占比会下降。
2、乳源活性肽是来源于乳蛋白的由2-50个氨基酸序列组成并且具有不同生理功能的特异性蛋白质片段，由于它们具有高特异性、低毒、结构多样性高和分子量低等特点，被认为是应用于保健品或功能性食品的理想物质。乳蛋白中含有许多不同生物活性的肽序列，但这些生物活性肽只用通过一些手段才能被释放出来以后才能发挥其作用。获取乳蛋白的生物活性肽的方法主要有三种：发酵，利用微生物发酵乳源蛋白获取；酶解，利用内外源蛋白酶酶解乳蛋白获取；生物合成，根据生物活性肽的序列合成。
3、目前市面上含有水牛初乳的产品多为奶粉，近年牛初乳系列产品升级迭代，也已出现对牛初乳蛋白多肽开发的产品，但是多为固体产品，这是因为固体产品易保存，不易失活，效果影响性小。乳源生物活性肽活性强、易制备、来源广泛且天然安全，受到人们的普遍关注。在过去的数十年中，利用不同的制备技术和方法，不断从乳蛋白中发现具有新功能的生物活性肽。同时随着组学技术的迅猛发展，基于生物质谱的蛋白质组学技术也逐渐应用于乳源生物活性肽的研究，使得乳源生物活性肽的研究更加深入。但是，目前的技术中研究的含肽水牛乳制品中使用的太多为抗氧化肽，而水牛初乳源免疫活性肽产品还很少见报道。而且也没有针对胃肠耐受性等方面的研究；制成食品后生物活性肽作为功能肽时，要想在机体内发挥作用，需要到达作用位置才能发挥其生理作用。由于消化道消化酶的作用，蛋白质水解物的生物学特性可能保持正常、降低或增加。人体胃肠道内环境错综复杂，活性肽很容易受到胃蛋白酶、胰蛋白酶等多种酶的影响导致降解，从而失去其生物活性，无法实现理想功能。因此，有必要对经过胃肠消化后的水牛初乳源活性肽进行研究，使肽具有高免疫活性、高耐肠胃的特性，为肽类食品提供更广泛的应用空间。
技术实现思路
0、
技术实现要素：
1、鉴于上述内容，有必要对经过胃肠消化后的水牛初乳源活性肽进行研究，使肽具有高免疫活性、高耐肠胃的特性，为肽类食品提供更广泛的应用空间。
2、为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
3、一种水牛初乳乳源活性肽，所述乳源活性肽的氨基酸序列如seq id no.1、seq idno.2、seq id no.3、seq id no.4和/或seq id no.5所示。
4、本发明还包括一种制备所述水牛初乳乳源活性肽的方法，所述方法包括如下步骤：
5、(1)制备水牛初乳乳清蛋白(bw)、制备水牛初乳乳清蛋白酶解基料(bwh)、制备水牛初乳乳清蛋白-消化产物(bw-h)和水牛初乳乳清蛋白酶解基料-消化产物(bwh-h)
6、(2)多肽提取：将步骤(1)的bw、bwh、bw-h和bwh-h的样品分别加入适量的乙酸，充分振荡混匀，高速离心；取上清多肽萃取液，冷冻干燥，加入tfa复溶，过10k超滤管，0.1％tfa清洗2次，所得滤液使用c18 stagetip脱盐，真空干燥；
7、(3)干燥后肽段用tfa复溶，od260测定肽段浓度，进行lc-ms/ms分析；
8、(4)采用质谱数据库检索软件和蛋白质数据库进行检索分析，并使用在线网站biopep对检测出来的肽段进行潜在生物活性肽预测，筛选出具有免疫刺激、免疫调节的肽段；使用在线网站peptideranker对肽段的生物活性进行检测，其中活性评分大于0.5被认为具有生物活性，选择表达量最高的前10个肽且pr值>0.5的肽；并将筛选出来的肽段分别在分别粘贴至toxinpred、innovagen、allergenfp网站预测毒性、溶解性和致敏性即得所述乳源活性肽。
9、本发明还包括应用所述的水牛初乳乳源活性肽，所述方法包括如下步骤：
10、(1)制备乳清蛋白活性肽基料：将水牛初乳调节ph值后进行离心，从而除去上层的脂肪以及下层沉淀，得水牛初乳乳清蛋白溶液；将水牛初乳乳清蛋白溶液调节ph值为7.5后，加入酶进行酶解，得到酶解液；将酶解液离心、取上清液、ph调节至中性，然后加入所述水牛初乳乳源活性肽得到相应的水牛初乳乳源活性肽基料；
11、(2)制备生水牛脱脂乳：取生水牛乳作为原料乳，而后进行脱脂处理，得到脱脂乳；
12、(3)制备调制水牛乳：将步骤(1)所得的乳清蛋白活性肽基料与步骤(2)所得的脱脂水牛乳混合，将所得的混合物料与白砂糖、α-环糊精混合均匀后灭菌得到调制水牛乳。
13、本发明还包括应用所述的水牛初乳乳源活性肽，所述方法包括如下步骤：
14、(1)制备乳清蛋白活性肽基料：将水牛初乳进行酶解后、离心、取上清液、ph调节至中性，然后加入所述水牛初乳乳源活性肽得到相应的水牛初乳乳源活性肽基料；
15、(2)制备发酵水牛乳：取生水牛乳作为原料乳，而后进行脱脂处理，得到脱脂乳，控制所述部分脱脂乳的蛋白含量≥4.0g/100g；将所得的脱脂水牛乳与上述步骤(1)中所得乳清蛋白肽基料、白砂糖混合后进行灭菌处理，然后向混合物料中加入发酵菌种，在39～43℃条件下恒温发酵，当发酵乳微微析出乳清时停止发酵，在4℃后熟24h得到发酵水牛乳。
16、进一步的，所述步骤(1)中酶解使用的酶为中性蛋白酶，酶添加量6299u/g，ph值为7.5，酶解时间为2.0h，酶活力为50u/mg。
17、本发明具有如下有益效果：
18、1、本发明利用单因素和响应面分析的方法研究水牛初乳生产水牛初乳乳清蛋白酶解基料，得出具有高abts自由基清除率的水牛初乳源乳清蛋白酶解基料，为整个工艺研究提供了基础，经优化，得出水牛初乳的最佳酶解条件为酶添加量6299u/g，ph值为7.5，酶解时间为2.0h，酶活力为50u/mg，优先选用中性蛋白酶。
19、2、本申请基于bw(水牛初乳乳清蛋白)、bwh(水牛初乳乳清蛋白酶解基料)、bw-h(水牛初乳乳清蛋白-消化产物)和bwh-h(水牛初乳乳清蛋白酶解基料-消化产物)四个样品，进行多肽组学与生物信息学的研究得出了表达量最高的几个免疫肽，将这几种免疫肽添加到水牛初乳乳清蛋白酶解基料中，有效提升了调制水牛乳和发酵水牛乳的抗氧化活性和免疫活性。
1.一种水牛初乳乳源活性肽，其特征在于，所述乳源活性肽的氨基酸序列如seq idno.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4和/或seq id no.5所示。
2.一种制备如权利要求1所述水牛初乳乳源活性肽的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
3.应用如权利要求1所述的水牛初乳乳源活性肽或如权利要求2所述方法制备得到的水牛初乳乳源活性肽制备调制乳的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
4.应用如权利要求1所述的水牛初乳乳源活性肽或如权利要求2所述方法制备得到的水牛初乳乳源活性肽制备发酵乳的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
5.根据权利要求3或权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中酶解使用的酶为中性蛋白酶，酶添加量6299u/g，ph值为7.5，酶解时间为2.0h，酶活力为50u/mg。
