本发明属于生物传感器，具体涉及一种基于ssdna-(6,5)-swcnt的ph近红外检测方法及其应用。
背景技术：
1、ph值是细胞内外环境的重要参数之一，与细胞增殖、凋亡、内吞作用、离子运输等关键生物过程密切相关。ph值的异常通常与生物体功能紊乱有关，对生物体内的生物化学反应、蛋白质构象和酶活性等产生重要影响。准确、快速地检测ph值对于生物医学研究、药物开发以及环境监测等领域至关重要。
2、cn109211851a公开了一种基于铜锌锡硫合金量子点的ph检测方法，铜锌锡硫合金量子点采用铜盐、锌盐、亚锡盐的低毒金属盐类化合物，高分子聚合物作为包覆稳定剂，滴加硫脲在水热条件下合成出铜锌锡硫合金量子点，随包覆剂的比例增加，发射波长可逐渐从紫外光区移向蓝光区域和可见光区域。在进行ph检测时，以铜锌锡硫合金量子点为荧光标记物，以使检测体系的荧光强度淬灭，即ph与荧光强度呈现线性淬灭关系，对比标准曲线，即可得到待测体系的ph。
3、过去几十年里，出现多种ph检测方法，如玻璃电极、光谱法、电化学等，但上述方法容易受到外界干扰，且操作较复杂。
4、核酸，作为生物体内的大分子，具有独特的结构和序列，通过改造和修饰核酸的分子结构和功能，可以赋予核酸探针良好的稳定性、选择性和灵敏度。核酸功能化的荧光探针利用核酸特异的结构和序列，可应用于复杂的生物体系中进行实时、无损的ph监测，成为ph检测领域的热点之一。因此，开发一种用于ph监测的核酸功能化的荧光探针具有重要的应用价值。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种基于ssdna-(6,5)-swcnt的ph近红外检测方法及其应用。所述检测方法在6.00-9.00的ph范围内，荧光探针的荧光强度变化与ph变化具有良好的相关性。在此ph区间内，荧光信号的荧光强度变化约50％，灵敏度达到了约16.7％/ph，显示出优异的检测性能。在对血清样品进行准确性研究发现，在酸性和弱碱性环境中所述方法与ph计检测结果基本一致，准确性较好。与传统方法相比本发明所述检测方法具有灵敏、准确和生物相容性好等优势。
2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
3、第一方面，本发明提供一种基于ssdna-(6,5)-swcnt的ph近红外检测方法，所述方法包括：
4、(a)将ph荧光探针溶液分别与待测样品和ph标准溶液混合反应，反应后进行近红外荧光光谱检测；
5、所述ph荧光探针溶液中包括表面含有ssdna修饰的(6,5)-swcnt，记为ssdna-(6,5)-swcnt，所述荧光探针溶液中ssdna-(6,5)-swcnt的终浓度为0.3-0.8mm，例如可以是0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm或0.8mm等；所述ssdna为含c碱基的ssdna；
6、(b)以ph值为横坐标，以荧光强度的变化率为纵坐标，对ph标准溶液的检测数据进行拟合，得到拟合方程；基于拟合方程计算待测样品的ph；所述荧光强度的变化率为的计算公式为：荧光强度的变化率＝(f-f7)/f7；
7、其中，f为实验组的最大荧光强度，f7为将ph荧光探针溶液调节至ph＝7.00后，所得溶液的最大荧光强度。
8、本发明利用单链dna(ssdna)和swcnts，设计了一种ssdna功能化的(6,5)-swcnt近红外荧光探针。该方法利用swcnts表面ssdna中胞嘧啶(c)碱基的质子化和去质子化过程，调控ssdna在swcnts表面的包裹紧密程度，从而影响swcnts的近红外荧光强度，实现不同ph值下快速准确的检测。与传统方法相比，这种核酸功能化的荧光探针具有灵敏、准确和生物相容性好等优势。
9、本发明考察了不同种类ssdna序列对ph的响应的影响，结果显示，不同ssdna替换的swcnts对ph的荧光响应存在显著差异。t碱基以及由at组成的(at)15和d序列(见实施例中表3)在不同ph值下的荧光强度变化较小，表明这些ssdna在swcnts表面的螺旋缠绕紧密度变化不大。而c碱基对不同ph的响应变化幅度较大，表明含c碱基的ssdna序列在swcnts表面缠绕紧密度会随着ph的变化而改变，从而引起荧光强度的变化。
10、优选地，步骤(a)中，所述ssdna的碱基的个数为15-30，例如可以是15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。
11、优选地，步骤(a)中，所述c碱基的个数为3-21，例如可以是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21。
12、本发明考察了c碱基的个数对ph检测的影响，结果表明，少量c碱基不利于质子化效应，导致ssdna在swcnts表面的螺旋结构变化较小，荧光变化率相对稳定。随着c碱基数量的增加，swcnts对不同ph的荧光响应显著增强。当c碱基数量增加至c15和c21时，虽然在ph＝8.50时荧光响应有所增强，但在ph＝6.00时荧光响应略有减弱；这可能是由于c碱基数量增加导致ssdna与swcnts的结合力减弱，部分削弱了质子化效应，使得荧光变化率在一定程度上减弱。鉴于c12在酸性和碱性条件下均展现出明显的荧光响应，并且整体荧光变化率最高，表明其在ph传感应用中具有最佳的性能，为了提高ph检测的灵敏度，选择了含有0-21个c碱基的ssdna序列进行后续研究。
13、优选地，步骤(a)中，所述c碱基以ccc组合分布，且在ssdna呈分散分布。
14、本发明考察了c碱基的位置对ph检测的影响，结果表明，c碱基的不同分布会导致荧光响应的差异，且大部分ssdna序列在酸性和碱性都有明显的响应。通过对比实验，结果发现c碱基以ccc组合分布的越分散，荧光信号的变化率越大。这可能是因为分散的ccc结构更容易发生质子化效应，使得ssdna在swcnts表面缠绕紧密程度的增加，从而引起更大的荧光信号改变。相反，h6是由12个c碱基的堆积分布，在酸性和碱性条件下荧光信号均降低，这不利于ph的检测。而h7(ccatccatccatccatccacc)在酸性和碱性条件下都表现出相对较弱的荧光响应，可能是因为ssdna结构都是cc的分布，即使cc碱基的分散程度较好，这种结构也不利于与h+的质子化效应，导致对不同ph的响应较弱。
15、优选地，步骤(a)中，所述ssdna-(6,5)-swcnt采用包括如下步骤的方法制备得到：
16、将(6,5)-swcnt溶液与ssdna溶液混合反应，得到混合液，再与甲醇混合直到出现浑浊，再采用异丙醇去除体系中的表面活性剂和多余的ssdna，离心收集沉淀得到ssdna-(6,5)-swcnt。
17、本发明中，采用双水相方法分离获得纯的(6,5)-swcnt上还包括分离(6,5)的过程中所用的表面活性剂有胆酸钠(sc)、脱氧胆酸钠(sdc)、十二烷基硫酸钠(sds)等。
18、优选地，所述探针溶液中(6,5)-swcnt溶液的浓度为0.1-1.5mg/ml，优选为0.3-0.8mg/ml，其中，0.1-1.5mg/ml例如可以是0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml、1.2mg/ml、1.4mg/ml或1.5mg/ml等。
19、本发明中，对分离纯化得到的(6,5)-swcnt进行稀释，并将其在980nm处吸收峰强度控制在2.1左右，待用。
20、优选地，所述ssdna溶液的浓度为0.107-2.941mg/ml，优选为0.204-1.429mg/ml；其中，0.107-2.941mg/ml例如可以是0.107mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml、2.5mg/ml或2.941mg/ml等。
21、优选地，所述(6,5)-swcnt溶液与ssdna溶液混合的体积比为120:(1.3-50)，优选为120:(2.5-20)；其中，120:(1.3-50)，例如可以是120:1.3、120:2.5、120:5、120:10、120:15、120:20、120:25、120:30、120:35、120:40、120:45或120:50等。
22、优选地，所述甲醇与混合液的体积比为(1-5):(1-5)，例如可以是1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、5:1、5:2、5:3或5:4等。
23、优选地，步骤(a)中，所述混合反应的体系中ssdna-(6,5)-swcnt的终浓度为0.03-0.08mm，例如可以是0.03mm、0.04mm、0.05mm、0.06mm、0.07mm或0.08mm等。
24、优选地，步骤(a)中，所述ph标准溶液的ph值在6.00-9.00范围内，例如可以是6.00、7.00、8.00或9.00等。
25、优选地，步骤(a)中，所述ph标准溶液包括：pb缓冲溶液。
26、优选地，步骤(a)中，所述混合反应的时间为15-90min，例如可以是15min、30min、45min、60min、75min或90min等。
27、优选地，步骤(a)中，所述混合反应的温度为20-24℃，例如可以是20℃、21℃、22℃、23℃或24℃等。
28、优选地，步骤(b)中，使用boltzmann方程进行拟合。
29、作为本发明的优选实施方式，所述基于ssdna-(6,5)-swcnt的ph近红外检测方法包括：
30、(a)将ph荧光探针溶液分别与待测样品和ph标准溶液混合反应，所述混合反应的时间为15-90min，所述混合反应的温度为20-24℃；所述混合反应的体系中ssdna-(6,5)-swcnt(ph荧光探针)的终浓度为0.03-0.08mm；反应后进行近红外荧光光谱检测。
31、所述ph荧光探针溶液中包括表面含有ssdna修饰的(6,5)-swcnt，记为ssdna-(6,5)-swcnt，所述荧光探针溶液中ssdna-(6,5)-swcnt的终浓度为0.3-0.8mm；所述ssdna为含c碱基的ssdna。
32、所述ph标准溶液的ph值在6.00-9.00范围内，所述ph标准溶液包括：pb缓冲溶液。
33、所述ssdna-(6,5)-swcnt采用包括如下步骤的方法制备得到：将(6,5)-swcnt溶液与ssdna溶液混合反应，其中，(6,5)-swcnt溶液的浓度为0.1-1.5mg/ml，ssdna溶液的浓度为0.107-2.941mg/ml，所述(6,5)-swcnt溶液与ssdna溶液混合的体积比为(120:1.3)-(120:50)；混合反应后得到混合液；再将混合液与甲醇按体积比为(1-5):(1-5)混合直到出现浑浊，再采用异丙醇去除体系中的表面活性剂和多余的ssdna，离心收集沉淀得到ssdna-(6,5)-swcnt。
34、(b)以ph值为横坐标，以荧光强度的变化率为纵坐标，对ph标准溶液的检测数据进行拟合，使用boltzmann方程进行拟合得到拟合方程；基于拟合方程计算待测样品的ph；所述荧光强度的变化率为的计算公式为：荧光强度的变化率＝(f-f7)/f7；
35、其中，f为实验组的最大荧光强度，f7为将ph荧光探针溶液调节至ph＝7.00后，所得溶液的最大荧光强度。
36、第二方面，本发明提供一种基于ssdna-(6,5)-swcnt的ph近红外荧光探针，所述荧光探针为第一方面所述ssdna-(6,5)-swcnt。
37、第三方面，本发明提供一种基于ssdna-(6,5)-swcnt的ph近红外检测试剂盒，所述试剂盒包括第二方面所述的基于ssdna-(6,5)-swcnt的ph近红外荧光探针。
38、优选地，所述试剂盒还包括用于计算标准曲线的ph标准溶液。
39、优选地，所述ph标准溶液的ph值在6.00-9.00范围内，例如可以是6.00、7.00、8.00或9.00等。
40、优选地，所述ph标准溶液包括：pb缓冲溶液。
41、第四方面，本发明提供一种基于ssdna-(6,5)-swcnt的ph近红外荧光探针传感器，所述传感器包括与检测样品发生反应的荧光探针溶液；
42、所述荧光探针溶液包括表面含有ssdna修饰的(6,5)-swcnt，记为ssdna-(6,5)-swcnt；所述荧光探针溶液中ssdna-(6,5)-swcnt的终浓度为0.3-0.8mm；所述ssdna为含c碱基的ssdna。
43、优选地，所述ssdna的碱基的个数为15-30，例如可以是15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。
44、优选地，所述c碱基的个数为3-21，例如可以是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21。
45、优选地，所述c碱基以ccc组合分布，且在ssdna呈分散分布。
46、优选地，所述传感器还包括ph标准溶液。
47、优选地，所述所述ph标准溶液的ph值在6.00-9.00范围内，例如可以是6.00、7.00、8.00或9.00等。
48、优选地，所述ph标准溶液包括：pb缓冲溶液。
49、优选地，所述传感器还包括近红外荧光光谱检测仪器。
50、优选地，所述ssdna-(6,5)-swcnt采用包括如下步骤的方法制备得到：
51、将(6,5)-swcnt溶液与ssdna溶液混合反应，得到混合液，再与甲醇混合直到出现浑浊，再采用异丙醇去除体系中的表面活性剂和多余的ssdna，离心收集沉淀得到ssdna-(6,5)-swcnt。
52、优选地，所述探针溶液中(6,5)-swcnt溶液的浓度为0.1-1.5mg/ml，优选为0.3-0.8mg/ml；其中，0.1-1.5mg/ml例如可以是0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml、1.2mg/ml、1.4mg/ml或1.5mg/ml等。
53、优选地，所述ssdna溶液的浓度为0.107-2.941mg/ml，优选为0.204-1.429mg/ml；其中，0.107-2.941mg/ml例如可以是0.107mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml、2.5mg/ml或2.941mg/ml等。
54、优选地，所述(6,5)-swcnt溶液与ssdna溶液混合的体积比为120:(1.3-50)，优选为120:(2.5-20)；其中，120:(1.3-50)，例如可以是120:1.3、120:2.5、120:5、120:10、120:15、120:20、120:25、120:30、120:35、120:40、120:45或120:50等。
55、优选地，步骤s2中，所述甲醇与混合液的体积比为(1-5):(1-5)，例如可以是1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、5:1、5:2、5:3或5:4等。
56、优选地，所述传感器的使用方法包括：
57、(i)将ph荧光探针溶液分别与待测样品和ph标准溶液混合反应，反应后进行近红外荧光光谱检测；
58、(ii)以ph值为横坐标，以荧光强度的变化率为纵坐标，对ph标准溶液的检测数据进行拟合，得到拟合方程；基于拟合方程计算待测样品的ph；所述荧光强度的变化率为的计算公式为：荧光强度的变化率＝(f-f7)/f7；
59、其中，f为实验组的最大荧光强度，f7为将ph荧光探针溶液调节至ph＝7.00后，所得溶液的最大荧光强度。
60、优选地，步骤(i)中，所述混合反应的体系中ssdna-(6,5)-swcnt的终浓度为0.03-0.08mm，例如可以是0.03mm、0.04mm、0.05mm、0.06mm、0.07mm或0.08mm等。
61、优选地，步骤(i)中，所述ph标准溶液的ph值在6.00-9.00范围内，例如可以是6.00、7.00、8.00或9.00等。
62、优选地，步骤(i)中，所述ph标准溶液包括：pb缓冲溶液。
63、优选地，步骤(i)中，所述混合反应的时间为15-90min，例如可以是15min、30min、45min、60min、75min或90min等。
64、优选地，步骤(i)中，所述混合反应的温度为20-24℃，例如可以是20℃、21℃、22℃、23℃或24℃等。
65、优选地，步骤(ii)中，使用boltzmann方程进行拟合。
66、第五方面，本发明提供第一方面所述的基于ssdna-(6,5)-swcnt的ph检测方法、第二方面所述的基于ssdna-(6,5)-swcnt的ph近红外荧光探针、第三方面所述的基于ssdna-(6,5)-swcnt的ph近红外检测试剂盒或第四方面所述的基于ssdna-(6,5)-swcnt的ph近红外荧光探针传感器中任意一种或至少两种的组合在ph检测中的应用。
67、本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
68、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
69、本发明基于swcnts表面含c碱基的ssdna在溶液中的质子化效应，可能导致ssdna与swcnts之间螺旋包裹的紧密程度的变化，从而引起swcnts荧光强度的改变，本发明设计的ssdna-(6,5)-swcnt ph荧光探针在ph 6.11-8.90范围内，荧光强度对ph的变化非常敏感，呈良好的相关性。在这个范围内，荧光强度变化约50％，灵敏度约16.7％/ph。在对血清样品进行准确性研究发现，在酸性和弱碱性环境中该荧光探针与ph计检测结果基本一致，准确性较好。
1.一种基于ssdna-(6,5)-swcnt的ph近红外检测方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的基于ssdna-(6,5)-swcnt的ph近红外检测方法，其特征在于，步骤(a)中，所述ssdna的碱基的个数为15-30；
3.根据权利要求1或2所述的基于ssdna-(6,5)-swcnt的ph近红外检测方法，其特征在于，步骤(a)中，所述ssdna-(6,5)-swcnt采用包括如下步骤的方法制备得到：
4.根据权利要求1-3中任一项所述的基于ssdna-(6,5)-swcnt的ph近红外检测方法，其特征在于，步骤(a)中，所述混合反应的体系中ssdna-(6,5)-swcnt的终浓度为0.03-0.08mm；
5.一种基于ssdna-(6,5)-swcnt的ph近红外荧光探针，其特征在于，所述荧光探针为权利要求1-4中任一项所述ssdna-(6,5)-swcnt。
6.一种基于ssdna-(6,5)-swcnt的ph近红外检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求5所述的基于ssdna-(6,5)-swcnt的ph近红外荧光探针；
7.一种基于ssdna-(6,5)-swcnt的ph近红外荧光探针传感器，其特征在于，所述传感器包括与检测样品发生反应的荧光探针溶液；
8.根据权利要求7所述的基于ssdna-(6,5)-swcnt的ph近红外荧光探针传感器，其特征在于，所述ssdna的碱基的个数为15-30；
9.根据权利要求7或8所述的基于ssdna-(6,5)-swcnt的ph近红外荧光探针传感器，其特征在于，所述ssdna-(6,5)-swcnt采用包括如下步骤的方法制备得到：
10.权利要求1-4中任一项所述的基于ssdna-(6,5)-swcnt的ph检测方法、权利要求5所述的基于ssdna-(6,5)-swcnt的ph近红外荧光探针、权利要求6所述的基于ssdna-(6,5)-swcnt的ph近红外检测试剂盒或权利要求7-9中任一项所述的基于ssdna-(6,5)-swcnt的ph近红外荧光探针传感器中任意一种或至少两种的组合在ph检测中的应用。
