本发明涉及生物医药，具体涉及一种重组腺相关病毒aav-lec及其制备方法和应用。
背景技术：
1、据世界卫生组织估计，目前有超过3300万人患有阿尔茨海默病(ad)，这是导致痴呆症的主要原因。淀粉样蛋白级联理论认为，淀粉样蛋白-β(aβ)肽是淀粉样蛋白斑块的主要成分。淀粉样蛋白级联假说认为，(aβ)肽的积累会诱发阿尔茨海默病(glenner gg,etal.1984)，随后出现tau磷酸化、神经细胞死亡，最终导致认知障碍(hardy ja,et al.1992；frisoni gb,et al.2022；sims r,et al.2020)。
2、淀粉样蛋白级联假说得到了遗传学研究的有力支持，因为淀粉样蛋白前体蛋白(app)、presenilin 1(psen1)和psen2蛋白的常染色体显性突变会增加aβ的产生，从而导致家族性ad，且几乎具有100％的外显率(chartier-harlin mc,et al.1991；goate a,etal.1991；murrell j et al.1991；reitz c,et al.2023)。app多拷贝(如21三体综合征)的人经常会患上早发性ad(wiseman fk,et al.2015；mumford p,et al.2022；rovelet-lecrux a,et al.2006)。表达突变的人类app和psen1显性突变体的各种转基因小鼠也表现出类似ad的病理特征(jankowsky jl,et al.2004；oakley h,et al.2006；sasaguri h,etal.2017)。相反，导致aβ生成减少的突变可降低ad风险(jonsson t,et al.2012)。
3、淀粉样蛋白级联假说认为，如果能抑制aβ的生成或增强aβ的清除，就能阻止ad的发展(gu x,et al.2024；neatu m,et al.2023；karran e,et al.2022)。过去几十年来，治疗策略主要集中在抑制aβ生成或提高aβ清除率上。由于缺乏疗效和毒副作用，十几项旨在减少aβ的临床试验屡屡失败，人们对此产生了怀疑(panza f,et al.2019；zhang y,etal.2023)。尽管如此，两种抗aβ单克隆抗体药aducanumab和lecanemab显示出临床疗效，并分别于2021年和2023年获得美国食品药品管理局批准(sevigny j,et al.2016；van dyckch,et al.2023)。然而，由于血脑屏障的通透性较低，需要10mg/kg的高剂量抗aβ抗体才能有效减少aβ斑块(pardridge wm.2020)。
4、累积的证据表明，抗aβ疗法有望改善甚至预防ad的进展，但这些疗法都出现了淀粉样蛋白相关成像异常(aria)，其中脑水肿或出血是最常见的不良反应(gu x,etal.2024；sevigny j,et al.2016；van dyck ch,et al.2023；honig ls,et al.2023)。这种副作用可能是由于抗体与血管中的淀粉样蛋白沉积结合，引发了炎症反应(taylor x,etal.2023)。因此，迫切需要副作用更小的有效疗法。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种能够将抗aβ单克隆抗体药穿过血脑屏障且副作用低的给药系统，实现抗aβ单克隆抗体药在中枢神经系统靶向释放发挥抗aβ作用，用于改善阿尔茨海默病的进展。
2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
3、本发明提供了一种重组腺相关病毒aav-lec，所述aav-lec为表达抗aβ抗体的腺相关病毒，所述抗aβ抗体为由用于引导蛋白分泌到胞外的信号肽、柔性连接肽连接的仑卡奈单抗轻链可变区和重链可变区、igg恒定区fc段组成的融合蛋白形成。
4、本发明利用具有增强中枢神经系统递送能力的腺相关病毒(aav)作为抗aβ抗体编码基因的递送载体，构建重组腺相关病毒aav-lec。动物实验表明，利用该重组病毒成功地将表达抗aβ抗体的基因递送至阿尔茨海默病(ad)模型动物的大脑中，并在脑中表达抗aβ抗体，显著减少aβ斑块的形成，进而显著改善ad病理症状。因此，本发明提供的重组腺相关病毒aav-lec可以应用于制备治疗和预防阿尔茨海默病的药物。
5、本发明中，根据抗aβ单克隆抗体药仑卡奈单抗(lecanemab)的结构进行改造获得所述抗aβ抗体。所述抗aβ抗体的氨基酸序列从n端到c端依次由信号肽、仑卡奈单抗轻链可变区、柔性连接肽、仑卡奈单抗重链可变区、igg恒定区fc段组成。
6、具体的，本发明保留了仑卡奈单抗中轻链和重链的可变区，保留其抗原结合区域。两者之间采用柔性连接肽连接，连接子可弯折以保证抗体结构的形成。重链可变区c末端融合igg恒定区fc段，融合蛋白表达后组装形成抗体结构。由于αβ淀粉蛋白主要沉积在细胞外，本发明在抗体蛋白n端融合了信号肽，引导抗体分泌到细胞外。
7、作为优选，所述信号肽的氨基酸序列如seq id no.1所示。本发明可采用信号肽并不局限以此，也可以采用其他的具有引导蛋白质分泌到胞外的信号肽。
8、作为优选，所述仑卡奈单抗的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如seqid no.2、seq id no.3所示。
9、作为优选，所述柔性连接肽的氨基酸序列如seq id no.4所示。本发明可采用柔性连接肽并不局限以此。
10、作为优选，所述igg恒定区fc段的氨基酸序列如seq id no.5所示。本发明可采用igg恒定区fc段并不局限以此，也可以采用仑卡奈单抗的fc段。
11、本发明提供的重组腺相关病毒aav-lec中含有抗aβ抗体基因表达框，在构建基因表达框时可根据宿主细胞的密码子偏好性对上述抗aβ抗体的编码基因进行密码子优化。
12、所述抗aβ抗体的编码基因依次由起始密码子、信号肽编码序列、轻链可变区编码序列、柔性连接肽编码序列、重链可变区编码序列、igg恒定区fc段编码序列、终止密码子组成。
13、作为优选，所述信号肽、轻链可变区、柔性连接肽、重链可变区、igg恒定区fc段的编码序列分别如seq id no.6、seq id no.7、seq idno.8、seq id no.9、seq id no.10所示。
14、作为优选，所述抗aβ抗体基因表达框中启动子采用ef1a启动子。
15、本发明还提供了一种利用腺相关病毒载体系统质粒制备所述重组腺相关病毒aav-lec的方法，包括：将腺相关病毒载体系统质粒转染到293t细胞中，培养后按时收集细胞培养上清液，浓缩后与细胞裂解上清夜混合经纯化、脱盐获得所述重组腺相关病毒aav-lec；所述腺相关病毒载体系统质粒包括含有抗aβ抗体基因表达框的转移质粒、编码复制和衣壳蛋白的表达质粒和辅助质粒helper，三者按照1：1：4比例转染。转染时，质粒与聚乙烯亚胺(pei)的比例为1：3。
16、作为优选，所述腺相关病毒的血清型选自：aav9、aav-php.a、aav-php.b、aav.php.eb、aav.bi-htfr1、aav-as。这些血清型的aav病毒具有高效穿透血脑屏障进入中枢神经系统的能力。
17、本发明还提供了所述的重组腺相关病毒aav-lec在制备治疗和预防阿尔茨海默病的药物中的应用，所述药物通过静脉注射穿过血脑屏障在中枢神经系统表达抗aβ抗体。动物实验表明，本发明提供的重组腺相关病毒aav-lec能够穿过血脑屏障递送抗aβ抗体基因至中枢神经系统，并在脑组织中有效表达抗aβ抗体，大脑神经元中表达aβ抗体可显著减少aβ斑块的形成，还减少了小胶质细胞和星形胶质细胞的活化，显著改善ad模型动物的认知功能。
18、本发明还提供了所述的重组腺相关病毒aav-lec在制备缓解阿尔茨海默病导致的脂质代谢功能异常的药物中的应用。本发明通过转录组测序分析发现，与对照组相比，经重组腺相关病毒aav-lec治疗后ad模型动物肝脏中与脂质代谢相关的基因明显下调，表明aav-lec介导的免疫疗法起到缓解脂质代谢异常的功能。
19、安全性评估性实验结果显示，利用本发明提供的重组腺相关病毒aav-lec介导的免疫疗法不会引起脑部微出血或肝脏炎症，表明本发明提供的药物副作用小。
20、本发明的另一个目的是提供一种重组腺相关病毒aav-lec制剂，所述制剂包括有效剂量的重组腺相关病毒aav-lec和药学上可接受的载体。
21、所述制剂以重组腺相关病毒aav-lec为主要活性成分，添加药剂学上可接受的载体制成，可按照药剂学上记载的制剂制备方法制成制剂。制剂形式可以为但不限于注射制剂。具体给药量根据疾病种类、疾病程度、年龄及给药目的进行调节。
22、作为优选，所述制剂中病毒滴度为1.0×1012-1.0×1013vg/ml。
23、术语说明：
24、术语“包括”为开放式表达，即包含本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。
25、术语“治疗”，在其中一些实施方案中指改善疾病或病症(即减缓或阻止或减轻疾病或其至少一种临床症状的发展)。在另一些实施方案中指缓和或改善至少一种身体参数，包括可能不为受试者所察觉的身体参数。在另一些实施方案中指从身体上(例如稳定可察觉的症状)或生理学上(例如稳定身体的参数)或上述两方面调节疾病或病症。在另一些实施方案中指预防或延迟疾病或病症的发生、发作或恶化。
26、术语“有效剂量”是指当施用受试者来治疗疾病时，化合物的分量足够对这种疾病的治疗起效。有效剂量可以随着疾病的严重程度，以及有待治疗的受试者的身体条件，年龄，体重，性别等而改变。
27、术语“药学上可接受的载体”是指能够递送本发明有效剂量活性物质，不干扰活性物质的生物活性并且对宿主或受试者无毒副作用的任何制剂或载体介质。
28、本发明具备的有益效果：
29、本发明利用腺相关病毒(aav)作为载体构建能够穿过血脑屏障的重组腺相关病毒aav-lec，该重组病毒携带抗aβ抗体基因表达框，穿透血脑屏障后在中枢神经系统表达抗aβ抗体，抗aβ抗体保留了仑卡奈单抗的抗原结合区域，可发挥与αβ淀粉蛋白结合的作用；抗体蛋白n端融合信号肽，负责将蛋白质引导到细胞外，与沉积在胞外的αβ淀粉蛋白结合，抑制aβ斑块的形成，显著改善阿尔茨海默病的病理症状。本发明提供的aav-lec可实现药物的靶向释放和作用，避免直接抗体给药存在的易引发炎症反应的问题，减少副作用产生。
1.一种重组腺相关病毒aav-lec，其特征在于，所述aav-lec为表达抗aβ抗体的腺相关病毒，所述抗aβ抗体为由用于引导蛋白分泌到胞外的信号肽、柔性连接肽连接的仑卡奈单抗轻链可变区和重链可变区、igg恒定区fc段组成的融合蛋白形成。
2.如权利要求1所述的重组腺相关病毒aav-lec，其特征在于，所述信号肽的氨基酸序列如seq id no.1所示。
3.如权利要求1所述的重组腺相关病毒aav-lec，其特征在于，所述仑卡奈单抗的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如seq id no.2、seq id no.3所示；所述柔性连接肽的氨基酸序列如seq id no.4所示。
4.如权利要求1所述的重组腺相关病毒aav-lec，其特征在于，所述igg恒定区fc段的氨基酸序列如seq id no.5所示。
5.如权利要求1所述的重组腺相关病毒aav-lec，其特征在于，所述aav-lec含有抗aβ抗体基因表达框，所述抗aβ抗体的编码基因依次由起始密码子、信号肽编码序列、轻链可变区编码序列、柔性连接肽编码序列、重链可变区编码序列、igg恒定区fc段编码序列、终止密码子组成，所述信号肽、轻链可变区、柔性连接肽、重链可变区、igg恒定区fc段的编码序列分别如seq id no.6、seq id no.7、seq id no.8、seq id no.9、seq id no.10所示。
6.如权利要求5所述的重组腺相关病毒aav-lec，其特征在于，所述抗aβ抗体基因表达框中启动子采用ef1a启动子。
7.如权利要求1-6任一项所述的重组腺相关病毒aav-lec的制备方法，其特征在于，包括：将腺相关病毒载体系统质粒转染到293t细胞中，培养后按时收集细胞培养上清液，浓缩后与细胞裂解上清夜混合经纯化、脱盐获得所述重组腺相关病毒aav-lec；所述腺相关病毒载体系统质粒包括含有抗aβ抗体基因表达框的转移质粒、编码复制和衣壳蛋白的表达质粒和辅助质粒helper，三者按照1：1：4比例转染。
8.如权利要求7所述的重组腺相关病毒aav-lec的制备方法，其特征在于，所述腺相关病毒的血清型选自：aav9、aav-php.a、aav-php.b、aav.php.eb、aav.bi-htfr1、aav-as。
9.如权利要求1-6任一项所述的重组腺相关病毒aav-lec在制备治疗和预防阿尔茨海默病的药物或缓解阿尔茨海默病导致的脂质代谢功能异常的药物中的应用，其特征在于，所述药物通过静脉注射能穿过血脑屏障在中枢神经系统表达抗aβ抗体。
10.重组腺相关病毒aav-lec制剂，其特征在于，所述制剂包括如权利要求1-6任一项所述的重组腺相关病毒aav-lec和药学上可接受的载体。
