1.本发明属于蛋白质递送技术领域，具体涉及一种膜融合性脂质体、制备方法及其在蛋白质递送中的应用。
背景技术：2.多数疾病都是由蛋白质功能障碍引起的，这使得蛋白质成为潜在的候选药物。例如，胰岛素、单克隆抗体、细胞因子、转录因子、酶和多肽等蛋白质被开发为治疗糖尿病、癌症、心血管疾病、细菌感染等疾病的药物。与传统化学药物相比，蛋白质治疗具有更高的特异性、更低的不良反应、更短的药物开发周期。与遗传药物相比，蛋白质作用于靶标更直接、更特异地调控生物过程，避免了永久性基因突变、基因持续表达引起的脱靶效应以及致癌风险。然而，目前市场上所有的蛋白质药物都是基于细胞外靶点开发的，而没有作用于细胞内靶点的。主要原因是蛋白质难以进入细胞内，细胞摄取效率较低。目前，蛋白质药物主要通过内含体介导的细胞摄取进入细胞，部分蛋白质在溶酶体中发生降解，部分蛋白质发生胞吐作用排出细胞，余下少量蛋白质才能进入细胞质。因此，基于内含体摄取的蛋白质递送效率较低。而开发绕过溶酶体的非内含体介导的递送方式有望提高蛋白质的递送效率。
3.脂质体在递送小分子药物和核酸药物方面具有广泛的应用，可以有效提高药物的细胞递送效率。而膜融合性脂质体(fusogenic liposome，ful)是一类特殊的脂质体，理论上可以直接与细胞膜融合，并绕过溶酶体，将药物直接运送到细胞质中，避免了药物在溶酶体中的降解问题。目前，膜融合性脂质体中最有潜力的一类是包含疏水π分子的一类。此类膜融合脂质体由中性脂质分子、阳离子脂质分子和疏水π结构分子组成。中性分子可稳定融合中间态，阳离子脂质分子具有正电荷，可增加与细胞的静电吸引力。疏水π结构分子能够促进脂质体与细胞膜发生膜融合。但是，现有的膜融合性脂质体尚不能满足高效蛋白质递送的需求，其融合效率仍然有待提高。
技术实现要素：4.针对上述现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于设计提供一种膜融合性脂质体、制备方法及其在蛋白质递送中的应用。本发明膜融合性脂质体作为纳米载体通过膜融合的方式一步将蛋白质药物递送到胞质中，相比于通过内吞途径介导蛋白质胞质递送，具有递送速度快和递送效率高的优点。并且制备过程简单，成本低，使用方便，且不需要对蛋白质进行修饰。
5.为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
6.一种膜融合性脂质体，其特征在于所述膜融合性脂质体包括中性脂质分子、阳离子脂质分子和疏水大共轭π结构分子，其中π的电子数不少于28。
7.所述的一种膜融合性脂质体，其特征在于所述中性脂质分子的头基为磷脂酰胆碱或磷脂酰乙醇胺且相变温度在37度以下，所述中性脂质分子包括二油酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺、1-棕榈酰基-2-油酰
基-sn-甘油-3-油酰磷脂酰胆碱、l-α-磷脂酰乙醇胺、l-α-磷脂酰胆碱等。
8.所述的一种膜融合性脂质体，其特征在于所述阳离子脂质分子的相变温度在37度以下，所述阳离子脂质分子包括(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺、1,2-二油酰氧基-3-二甲基氨基丙烷、溴化双十二烷基三甲铵、1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱、二油酰乙基磷脂酰胆碱等。
9.所述的一种膜融合性脂质体，其特征在于所述疏水大共轭π结构分子包括cybi7、cybi5等，cybi7(nano research,2021,14(7),2432-2440)的化学结构式如下式ⅰ所示，cybi5(colloids surf b biointerfaces,2021,199:111537)的化学结构式如下式ⅱ所示。其中cybi7为近红外荧光染料，所述疏水大共轭π结构分子由结构对称合成法或不对称合成法合成获得。
[0010][0011]
所述的一种膜融合性脂质体，其特征在于所述中性脂质分子、阳离子脂质分子和疏水大共轭π结构分子的摩尔比为20～70:20～70:1～10，优选为45～55:45～55:5～10，最优选为50:50:5，所述膜融合性脂质体的粒径为50～200nm。
[0012]
一种任一所述的一种膜融合性脂质体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
[0013]
(1)称取中性脂质分子、阳离子脂质分子和疏水大共轭π结构分子溶解于溶剂中，蒸发除去溶剂，形成脂质膜；
[0014]
(2)取纯水加入到上述步骤(1)形成的脂质膜中，在水浴涡旋转进行水合，得到脂质体溶液；
[0015]
(3)在惰性气体气氛下，将步骤(2)得到的脂质体溶液用脂质体挤出器挤出，得到粒径分布均匀的脂质体分散液；
[0016]
(4)将步骤(3)得到的脂质体分散液加入纯水中进行透析，得到疏水夹层包裹π结构分子的膜融合性脂质体。
[0017]
所述的制备方法，其特征在于所述步骤(1)中的溶剂为卤代烷烃类溶剂或醇类溶剂，所述中性脂质分子、阳离子脂质分子和疏水大共轭π结构分子的摩尔比为20～70:20～70:1～10，优选为45～55:45～55:5～10，最优选为50:50:5。
[0018]
所述的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中纯水加入至使脂质体溶液中磷脂浓度为1-50mm。
[0019]
所述的制备方法，其特征在于所述步骤(3)中所述惰性气体为氮气，所述挤出的次数为5～20次；
[0020]
所述步骤(4)中透析的次数为3～5次。
[0021]
任一所述的膜融合性脂质体作为纳米载体在胞内递送蛋白质或基因药物中的用
途；
[0022]
所述蛋白质包括负电性的模型蛋白、蛋白质药物、疫苗，所述基因药物包括反义dna，反义rna，微小rna，小干扰rna，信使rna和质粒。
[0023]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0024]
1)本发明采用薄膜水化的方法，在脂质体夹层包载疏水大共轭π结构分子。将疏水大共轭π结构分子装载于脂质体的夹层中，有利于加速脂质体与细胞膜融合的过程。并且，cybi7是红外荧光染料，可以在荧光显微镜下直接观察细胞摄取融合性脂质体的情况。
[0025]
3)本发明膜融合性脂质体的制备方法和使用设备简单，操作容易掌控，成本低，使用方便，并且体外蛋白质递送效果好，为胞内递送的蛋白质药物提供了一种新的载体。
附图说明
[0026]
图1为膜融合性脂质体新鲜制备和放置两个月后的粒径分布；
[0027]
图2为膜融合性脂质体的体外膜融合效率随时间的变化；
[0028]
图3为膜融合性脂质体在胃癌细胞823细胞上的摄取情况；
[0029]
图4为膜融合性脂质体递送模型蛋白β-半乳糖苷酶的转染效率和酶活性；
[0030]
图5为膜融合性脂质体递送模型蛋白β-gal的细胞摄取机制；
[0031]
图6为膜融合性脂质体在胞内的递送蛋白质机制。
具体实施方式
[0032]
以下将结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
[0033]
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。
[0034]
以下实施例中，二油酰磷脂酰乙醇胺(dope)、(2，3-二油酰基-丙基)-三甲胺(dotap)、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dopc)、1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-(7-硝基-2,1,3-苯并恶二唑-4-基)(dppe-nbd)和1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-(丽丝胺罗丹明b)(dppe-rh)均购自avanti polar lipids生物公司；1，1'-双十八烷基-3，3，3'，3'-四甲基吲哚三碳菁碘化物(dir)购自aat bioquest；胆固醇(chol)购自北京百灵威科技有限公司。cybi7由对称合成法合成(nano research,2021,14(7),2432-2440)。基础培养基(rpmi-1640)、胎牛血清(fbs)购自gibco。d-无水葡萄糖和再生纤维素透析袋(3500d)购自上海源叶生物有限公司；β-半乳糖苷酶(β-gal)，β-半乳糖苷酶报告基因染色试剂盒、β-葡萄糖苷酶活性检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。lipofectamine 3000(lpf3k)购自赛默飞公司。
[0035]
实施例1：cybi7-ful的制备和稳定性表征
[0036]
cybi7-ful的制备方法如下：
[0037]
将二油酰磷脂酰乙醇胺(dope)、(2，3-二油酰基-丙基)-三甲胺(dotap)、cybi7以摩尔比为50:50:5(总的脂质摩尔浓度2mm)溶解在氯仿中，然后通过旋转蒸发除去氯仿，形成脂质膜；
[0038]
将纯水溶液加入到脂质膜中，于30℃水浴锅中旋转，对脂质膜进行水合。待形成的脂质膜水合变成乳液状脂质体混悬液后，用挤出器在100nm的聚碳酸酯膜上挤出10次；
[0039]
将挤出后的脂质体溶液用100mm的纯水中透析3次，得到cybi7-ful。
[0040]
本实施例还制备了文献中报道的膜融合性脂质体dir-ful作为对照研究组，其制备方法如下：
[0041]
将二油酰磷脂酰乙醇胺(dope)、(2，3-二油酰基-丙基)-三甲胺(dotap)、dir以摩尔比为50:50:5(总的脂质摩尔浓度2mm)溶解在氯仿中，然后通过旋转蒸发除去氯仿，形成脂质膜；
[0042]
将纯水溶液加入到脂质膜中，于30℃水浴锅中旋转，对脂质膜进行水合。待形成的脂质膜水合变成乳液状脂质体混悬液后，用挤出器在100nm的聚碳酸酯膜上挤出10次；
[0043]
将挤出后的脂质体溶液用纯水中透析3次，得到dir-ful。
[0044]
将cybi7-ful稀释于纯水中测定其新鲜制备时，及放置两个月后的粒径分布，结果见图1；由图1可知cybi7-ful粒径大小在140nm左右，两个月后脂质体粒径基本没有变化，由此可见本发明制备的膜融合性脂质体的稳定性较好。
[0045]
实施例2：cybi7-ful的体外膜融合效率
[0046]
利用膜融合性脂质体和模拟细胞膜成分脂质体之间的荧光共振能量转移效应测定膜融合效率。设定dir-ful为对照组，对比cybi7-ful和dir-ful的膜融合效率。具体地，首先合成模拟细胞膜成分的脂质体fret-l(dopc/chol/nbd-pe-pe/rho-pe 10/1/0.1/0.05)以及模拟完全膜融合的脂质体cybi7-f100(dopc/chol/nbd-pe/rho-pe/dir 10/1/0.01/0.005/0.50)和dir-f100(dopc/chol/nbd-pe/rho-pe/cybi710/1/0.01/0.005/0.50)。其次，将cybi7-ful和dir-ful与fret-l混合不同时间(0-60min)，测定rho-pe的荧光强度(rho-pe的终浓度为150nm，激发475nm，发射595nm)，分别除以cybi7-f100和dir-f100中rho-pe的荧光强度，得到不同时间的膜融合效率。如图2所示，与fret-l孵育10min后，cybi7-ful的膜融合效率98.6％，远高于dir-ful(28.9％)；而孵育20min后，cybi7-ful的膜融合效率已达到饱和100％，远高于dir-ful(32.6％)；孵育1h后，dir-ful的膜融合效率仍然不高，仅达到41.2％。这些结果说明，cybi7-ful具有快速和高效的膜融合能力。
[0047]
实施例3：cybi7-ful在胃癌细胞823细胞中的摄取情况
[0048]
将bgc-823细胞培养于含有10％fbs和1％p/s(青霉素/链酶素双抗)的rpmi-1640培养基中，培养瓶放置37℃，5％二氧化碳培养箱中进行培养。将823细胞接种到96孔板(0.5～1
×
104个/孔)，并在37℃，5％co2培养箱中培养24h。然后加入100μl含有cybi7-ful的无血清培养基(脂质浓度为80μm)，随后在培养箱中孵育不同时间(5min，10min，30min，60min)，接着用pbs洗3次，加入100μl的含血清培养基，最后在荧光显微镜(leica)下进行观察拍照(使用cy5通道检测cybi7)，用image j对荧光强度进行定量，结果如图3所示。在5min时，已经观察到cybi7-ful的细胞摄取；随着时间的延长，细胞摄取量逐渐增加，在30min时细胞摄取达到饱和，说明cybi7-ful的细胞摄取速度极快。
[0049]
实施例4：cybi7-ful递送β-gal的转染效率酶活性
[0050]
首先制备cybi7-ful以及对照组dir-ful和lpf3k与β-gal的复合物。其中cybi7-ful和dir-ful与β-gal复合物制备为cybi7-ful或dir-ful(2mm，13μl)与β-gal(1mg/ml，2.0μl)混合5min；lpf3k与β-gal的复合物制备为β-gal(1mg/ml，1.95μl)与无血清培养基(163μ
l)混合，然后与含lpf3k(3μl)的无血清培养基混合10min中。
[0051]
其次，测定各组递送β-gal的转染效率。由于β-gal是一种分子量较大(473kda)，带负电荷(pi＝5.1)的酶，自身难以透过细胞膜，同时它能够催化x-gal水解成不溶性蓝色染料和半乳糖，因此可以通过观测细胞内的蓝色物质判断不同处理条件下cybi7-ful介导β-gal的递送情况，测定转染效率。具体地，5000个/孔的密度在96孔板接种823细胞，待细胞密度达到80％时，在细胞中加入游离β-gal、lpf3k@β-gal、β-gal@dir-ful和β-gal@cybi7-ful(β-gal：6μg/ml)，孵育60min，随后进行细胞的固定和β-gal染色。具体固定和染色步骤如下：吸出细胞培养液，pbs洗3次。随后，加入100μl的β-gal染色固定液，室温固定10min。吸除细胞固定液，pbs洗三次，每次3min。吸除pbs，每孔加入100μl染色工作液，37℃孵育过夜。最后，用明场拍摄所有处理组中β-gal在细胞内的分布。应用image j统计含有蓝色物质的细胞的百分数，计算不同处理组转染效率，结果如图4a所示。
[0052]
在相同条件下，游离β-gal和lpf3k@β-gal的蛋白质转染效率可忽略不计，而dir-ful和cybi7-ful组的蛋白质平均转染效率分别为33.1％和79.4％。膜融合性脂质体的蛋白质递送效率远高于传统的内吞型脂质体lpf3k，而本发明开发的膜融合脂质体cybi7-ful又远高于文献报道的dir-ful。
[0053]
接着，测定各组递送β-gal的酶活性。具体地，5000个/孔的密度在96孔板接种823细胞，待细胞密度达到80％时，在细胞中加入游离β-gal、lpf3k@β-gal、β-gal@dir-ful和β-gal@cybi7-ful(β-gal：6μg/ml)，孵育60min，吸出细胞培养液，加入细胞裂解液孵育60min。接着在另一块96孔板中先加入裂解样品以及裂解液，后加入检测试剂，37度至少孵育3个小时，然后加入150μl na2co3溶液(1m)终止反应。立即测量反应液的光密度(420nm)。各组中β-gal的酶活性通过各组的光密度值与游离β-gal的酶活性的光密度值对比得到，如图4b所示。
[0054]
游离β-gal递送进入细胞的酶活性仅为6.5％；lpf3k包载β-gal达到了保护部分酶的作用，酶活性提升到21.9％；dir-ful为文献中已经报道的膜融合脂质体，其膜融合性能使得它比传统的脂质体对酶的保护作用得以加强，酶活性达到49.7％；而本发明中的cybi7-ful，由于其高效的膜融合能力，对酶的保护能力极强，酶活性达到92.5％。这些数据证明了cybi7-ful在用于蛋白质胞质递送时可以有效保护递送蛋白质的酶活性，远优于文献报道的dir-ful。
[0055]
实施例5：cybi7-ful递送-gal的细胞摄取机制
[0056]
分别将823细胞以5
×
104/ml的密度铺板于24孔板中，每孔1ml培养基。当细胞密度达到80％时，移去旧培养基，加入新培养基，设定抑制剂组、低温组、不加抑制剂组。在抑制剂组中，先加入各种抑制剂(氯丙嗪(cpz)10μg/ml、染料木素(genistein)150μm、渥曼青霉素(wortmanni)5μm、细胞松弛素(cb)10μg/ml和甲基
‑‑
环糊精(mβcd)5mg/ml)在培养箱中孵育30min；接着，加入cybi7-ful/-gal，在37度下继续孵育1.5h，随后进行细胞固定和β-gal染色。在低温组中，加入cybi7-ful/β-gal复合物，4℃孵育1.5h，随后进行细胞固定和β-gal染色。在不加抑制剂组中，直接将cybi7-ful/β-gal复合物与细胞在37℃下孵育1.5h，随后进行细胞固定和β-gal染色。与此同时，在不同抑制剂处理下，将dir-ful/β-gal复合物与细胞孵育1.5h，并进行细胞固定和β-gal染色。细胞的固定和β-gal染色以及图像处理方法同实施例4，结果如图5a和5b所示。
[0057]
结果表明，不加抑制剂组，cybi7-ful介导β-gal的平均转染效率为86.5％；4度处理后，平均转染效率为70.6％；不同内吞抑制剂处理后的平均转染效率为：染料木素(79.0％)、细胞松弛素β(76.8％)、甲基-β-环糊精(71.9％)、氯丙嗪(75.9％)、、渥曼青霉素(75.2％)。经过统计分析，4度处理和内吞抑制剂处理组的蛋白转染效率和不加抑制剂组没有显著性差异，说明cybi7-ful是依赖于非内吞的细胞摄取方式递送蛋白进入细胞的，蛋白质不存在溶酶体降解问题，与上文中的递送蛋白的高酶活性呼应。而对照组dir-ful介导β-gal的平均转染效率为39.8％，4度处理后，平均转染效率为9.4％；不同内吞抑制剂处理后的平均转染效率为：染料木素(22.1％)、细胞松弛素β(11.0％)、甲基-β-环糊精(8.5％)、氯丙嗪(41.5％)、渥曼青霉素(28.9％)。经过统计分析，4度组、细胞松弛素β组和甲基-β-环糊精组均与不加抑制剂组存在显著性差异，说明dir-ful虽然具有膜融合能力，但是仍有部分脂质体通过吞噬作用和脂筏介导的内吞方式进入细胞，导致其膜融合脂质体的潜能不能得到全部发挥。
[0058]
与文献报道的膜融合性脂质体dir-ful不同，本发明开发的cybi7-ful以全膜融合的方式进入细胞，可以充分发挥膜融合性脂质体的优势，绕过溶酶体，提升蛋白质递送效率和蛋白质活性，如图6。
[0059]
以上对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
技术特征：1.一种膜融合性脂质体，其特征在于所述膜融合性脂质体包括中性脂质分子、阳离子脂质分子和疏水大共轭π结构分子，其中π的电子数不少于28。2.如权利要求1所述的一种膜融合性脂质体，其特征在于所述中性脂质分子的头基为磷脂酰胆碱或磷脂酰乙醇胺且相变温度在37度以下，所述中性脂质分子包括二油酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-油酰磷脂酰胆碱、l-α-磷脂酰乙醇胺、l-α-磷脂酰胆碱。3.如权利要求1所述的一种膜融合性脂质体，其特征在于所述阳离子脂质分子的相变温度在37度以下，所述阳离子脂质分子包括(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺、1,2-二油酰氧基-3-二甲基氨基丙烷、溴化双十二烷基三甲铵、1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱、二油酰乙基磷脂酰胆碱。4.如权利要求1所述的一种膜融合性脂质体，其特征在于所述疏水大共轭π结构分子包括cybi7、cybi5，其中cybi7为近红外荧光染料。5.如权利要求1所述的一种膜融合性脂质体，其特征在于所述中性脂质分子、阳离子脂质分子和疏水大共轭π结构分子的摩尔比为20～70:20～70:1～10，优选为45～55:45～55:5～10，最优选为50:50:5，所述膜融合性脂质体的粒径为50～200nm。6.一种如权利要求1-5任一所述的一种膜融合性脂质体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)称取中性脂质分子、阳离子脂质分子和疏水大共轭π结构分子溶解于溶剂中，蒸发除去溶剂，形成脂质膜；(2)取纯水加入到上述步骤(1)形成的脂质膜中，在水浴涡旋转进行水合，得到脂质体溶液；(3)在惰性气体气氛下，将步骤(2)得到的脂质体溶液用脂质体挤出器挤出，得到粒径分布均匀的脂质体分散液；(4)将步骤(3)得到的脂质体分散液加入纯水中进行透析，得到疏水夹层包裹π结构分子的膜融合性脂质体。7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述步骤(1)中的溶剂为卤代烷烃类溶剂或醇类溶剂，所述中性脂质分子、阳离子脂质分子和疏水大共轭π结构分子的摩尔比为20～70:20～70:1～10，优选为45～55:45～55:5～10，最优选为50:50:5。8.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中纯水加入至使脂质体溶液中磷脂浓度为1-50mm。9.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述步骤(3)中所述惰性气体为氮气，所述挤出的次数为5～20次；所述步骤(4)中透析的次数为3～5次。10.如权利要求1-5任一所述的膜融合性脂质体作为纳米载体在胞内递送蛋白质或基因药物中的用途；所述蛋白质包括负电性的模型蛋白、蛋白质药物、疫苗，所述基因药物包括反义dna，反义rna，微小rna，小干扰rna，信使rna和质粒。
技术总结一种膜融合性脂质体、制备方法及其在蛋白质递送中的应用，属于蛋白质递送技术领域。本发明膜融合性脂质体包括中性脂质分子、阳离子脂质分子和疏水大共轭π结构分子，其中π的电子数不少于28。中性脂质分子、阳离子脂质分子和大共轭π结构分子的摩尔比为20～70:20～70:1～10。本发明膜融合性脂质体纳米载体通过膜融合的方式一步将蛋白质药物递送到胞质中，相比于通过内吞途径介导蛋白质胞质递送，具有递送速度快和递送效率高的优点。且制备过程简单，成本低，使用方便，不需要对蛋白质进行修饰。饰。饰。
技术研发人员：夏玉琼 张象涵 王忠良 汪军 吴克赟 曹建霞 陈昭旭 杨鹏 饶志萍 宁蓬勃
受保护的技术使用者：西安电子科技大学
技术研发日：2022.06.07
技术公布日：2022/11/1
