本发明涉及中药制剂分析，尤其是涉及一种双金连合剂的指纹图谱检测方法。
背景技术：
1、双金连合剂由黄芩、连翘、山银花、柴胡、金莲花五味药制备而成，具有辛凉解表、清热解毒的功效，主要用于外感风邪感冒引起的发热、疼痛、咳嗽。方中山银花具有清热解毒，疏散风热之功效，主要含有酚酸类、黄酮类、挥发油类、环烯醚萜类、皂苷类等化学成分，具有抗菌、抗氧化、解热抗炎、抗病毒、调节免疫及保肝等药理作用，主要与其中酚酸类、黄酮类成分有关。连翘具有清热解毒、消肿散结、疏散风热之功效，主要含有木脂素类、苯乙醇苷类、黄酮类、萜类及挥发油类、酚酸类等化学成分，具有抗炎、抑菌、抗病毒、抗氧化等药理作用。黄芩具有清热燥湿，泻火解毒之功效，主要有黄酮类、萜类、有机酸类等化学成分，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、保护神经元等药理作用，主要与其中黄酮类成分有关。柴胡具有疏散退热，疏肝解郁，升举阳气之功效，主要含有柴胡皂苷、柴胡多糖、挥发油类、黄酮类等化学成分，具有解热、抗炎抗病毒、抗肿瘤、保护心脏、抗动脉粥样硬化、保护肝脏、保护胃黏膜等药理作用。金莲花具有消肿、清热解毒之功效，主要含有黄酮类、有机酸类、生物碱类、香豆素类、甾醇类、苯乙素类、多糖类和神经酰胺类等化学成分，具有抗炎镇痛、抑菌、抗氧化、抗病毒、抗癌等药理作用。
2、双金连合剂现收载于2020年版《中国药典》第一增补本中，虽然有五味药材的薄层鉴别及黄芩、连翘、山银花、金莲花四味药材的含量测定等方法，但缺乏对产品一致性和质量稳定性的整体质量监控方案，质控手段有待进一步提高，且药材由于土壤、气候等环境因素及采收加工的不同，实际使用时不能保证药材质量的稳定，且生产过程中的不稳定性导致各批次产品之间质量出现差异，产品质量的批间一致性易受到影响，不利于产品疗效的稳健发挥。为保证双金连合剂质量与疗效的相对一致，需要对其质量检测方法进行研究，来整体控制其质量。中药指纹图谱是基于中药整体性控制思路出发，多采用色谱技术对其含有的化学成分进行系统的、整体的、专属的表征，是对中药质量进行整体控制，更加符合中药复杂体系的特征。
3、基于以上因素，建立一种双金连合剂的hplc指纹图谱检测方法，是对双金连合剂质量控制的补充和提高。
技术实现思路
1、针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明提供一种双金连合剂的指纹图谱检测方法，解决了现有双金连合剂质量控制缺乏整体性的问题。
2、本发明通过以下技术手段解决技术问题，一种双金连合剂的指纹图谱检测方法，包括如下步骤:
3、s1，供试品溶液的制备，精密量确适量的双金连合剂，置于容量瓶中，缓缓滴加溶剂稀释至刻度线，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液；
4、s2，混合对照品溶液的制备：分别取新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、隐绿原酸、藜芦酸、荭草苷、牡荆素、连翘酯苷a、异绿原酸b、芦丁、4,5-o-二咖啡酰奎宁酸、连翘苷、黄芩苷、汉黄芩苷适量，精密称定，加适量溶剂溶解，制得单个对照品溶液；再分别取单个对照品溶液适量，混匀；
5、s3，测定，分别精密吸取供试品溶液和混合对照品溶液适量，注入高效液相色谱仪，测定，记录色谱图；
6、s4，双金连合剂指纹图谱的构建，将不同批次的供试品溶液注入高效液相色谱仪测定，记录色谱图并与标准版本进行比对，标定共有峰，建立双金连合剂对照图谱并计算相似度。
7、优选的，所述步骤s1中精密量取双金连合剂的体积为3ml。
8、优选的，所述步骤s1中容量瓶的体积为10ml。
9、优选的，所述步骤s1和步骤s2中的溶剂为30％～90％甲醇。
10、优选的，所述甲醇为70％甲醇。
11、优选的，所述步骤s1和步骤s2中的微波滤膜的孔径为0.2～0.45um。
12、优选的，所述步骤s2中各单个对照品溶液的浓度为0.5mg/ml。
13、优选的，所述步骤s2中制备混合对照品溶液时，精密吸取各单个对照品溶液的量为100ul。
14、优选的，所述步骤s3中的高效液相色谱的条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱为固定相，以甲醇为流动相a，其中甲醇含有0.2％磷酸，以0.2％磷酸水为流动相b，按如下方式进行梯度洗脱；
15、时间0～5min，流动相a为8，流动相b为92；
16、时间5～15min，流动相a为8→16，流动相b为92→84；
17、时间15～60min，流动相a为16→25，流动相b为84→75；
18、时间60～90min，流动相a为25→40，流动相b为75→60；
19、时间90～100min，流动相a为40→45，流动相b为60→55；
20、时间100～140min，流动相a为45，流动相b为55；
21、时间140～145min，流动相a为45→8，流动相b为55→92；
22、时间145～160min，流动相a为8，流动相b为92。
23、优选的，所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱为：agilent 5tc-c18(2)4.6mm*250mm、5μm。
24、优选的，所述色谱柱柱温为24～27℃。
25、优选的，所述色谱柱柱温为25℃。
26、优选的，所述流动相的流速为0.9～1.1ml/min。
27、优选的，所述流动相的流速为1.0ml/min。
28、优选的，所述流动相a、b中磷酸的酸度均为0.05％～0.6％。
29、优选的，所述流动相a、b中磷酸的酸度均为0.2％。
30、优选的，采用波长切换的方式进行分析，波长切换方式如下，
31、时间0～112min，检测波长228nm；
32、时间112～140min，检测波长278nm；
33、时间140～160min，检测波长228nm。
34、优选的，所述步骤s4中以绿原酸的色谱峰作为参照，检测得到双金连合剂hplc指纹图谱中有30个共有峰，其中，峰5为新绿原酸，相对保留时间为0.577；峰8为绿原酸，相对保留时间为1.000；峰9为咖啡酸，相对保留时间为1.074；峰10为隐绿原酸，相对保留时间为1.113；峰12为藜芦酸，相对保留时间为1.768；峰15为荭草苷，相对保留时间为2.063；峰18为牡荆素，相对保留时间为2.192；峰20为连翘酯苷a，相对保留时间为2.299；峰21为异绿原酸b，相对保留时间为2.317；峰23为芦丁，相对保留时间为2.455；峰24为4,5-o-二咖啡酰奎宁酸，相对保留时间为2.579；峰25为连翘苷，相对保留时间为2.608；峰26为黄芩苷，相对保留时间为2.720；峰29为汉黄芩苷，相对保留时间为3.164。
35、本发明采用高效液相色谱法梯度洗脱-波长切换的方法建立了双金连合剂指纹图谱的检测方法，可得到有30个共有峰的指纹图谱，能反映出产品的多成分信息，检测方法简单、重现性好、特征峰多，可保证产品质量均一性、稳定性，可为该产品的质量控制提供科学依据，是双金连合剂产品质量检测方法上的创新。
1.一种双金连合剂的指纹图谱检测方法，其特征在于，包括如下步骤:
2.根据权利要求1所述的一种双金连合剂的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述步骤s1中精密量取双金连合剂的体积为3ml。
3.根据权利要求1所述的一种双金连合剂的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述步骤s1中容量瓶的体积为10ml。
4.根据权利要求1所述的一种双金连合剂的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述步骤s1和步骤s2中的溶剂为30％～90％甲醇。
5.根据权利要求1所述的一种双金连合剂的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述步骤s1和步骤s2中的微波滤膜的孔径为0.2～0.45um。
6.根据权利要求1所述的一种双金连合剂的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述步骤s2中各单个对照品溶液的浓度为0.5mg/ml。
7.根据权利要求1所述的一种双金连合剂的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述步骤s2中制备混合对照品溶液时，精密吸取各单个对照品溶液的量为100ul。
8.根据权利要求1所述的一种双金连合剂的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述步骤s3中的高效液相色谱的条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱为固定相，以甲醇为流动相a，其中甲醇含有0.2％磷酸，以0.2％磷酸水为流动相b，按如下方式进行梯度洗脱；
9.根据权利要求8所述的一种双金连合剂的指纹图谱检测方法，其特征在于，采用波长切换的方式进行分析，波长切换方式如下，
10.根据权利要求1所述的一种双金连合剂的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述步骤s4中以绿原酸的色谱峰作为参照，检测得到双金连合剂hplc指纹图谱中有30个共有峰，其中，峰5为新绿原酸，相对保留时间为0.577；峰8为绿原酸，相对保留时间为1.000；峰9为咖啡酸，相对保留时间为1.074；峰10为隐绿原酸，相对保留时间为1.113；峰12为藜芦酸，相对保留时间为1.768；峰15为荭草苷，相对保留时间为2.063；峰18为牡荆素，相对保留时间为2.192；峰20为连翘酯苷a，相对保留时间为2.299；峰21为异绿原酸b，相对保留时间为2.317；峰23为芦丁，相对保留时间为2.455；峰24为4,5-o-二咖啡酰奎宁酸，相对保留时间为2.579；峰25为连翘苷，相对保留时间为2.608；峰26为黄芩苷，相对保留时间为2.720；峰29为汉黄芩苷，相对保留时间为3.164。
