本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及一种在泰万菌素发酵中使用泰乐菌素精制液的方法。
背景技术：
1、泰万菌素是第三代动物专用大环内酯类药物，能到达支气管腔，杀灭支原体，具有抗菌性强、安全性高、耐药性少、低残留和无不良反应等诸多优点。对支原体、螺旋体、大部分革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性菌都有较强的抗菌活性。临床上主要用于动物体内急慢性呼吸道系统和消化道系统等疾病的防治。
2、这类抗生素主要通过微生物发酵工艺或半合成过程生产，微生物发酵工艺中主要采用泰乐菌素成品作为原料，在放线菌发酵体系中转化为泰万菌素。cn 117660573 a公开了一种泰乐菌素与泰万菌素绿色联产工艺，该方法通过将含泰乐菌素的滤液不经醋酸丁酯萃取纯化及喷雾干燥制备泰乐菌素成品，而是直接将含泰乐菌素的滤液用于后续放线菌发酵转化生成泰万菌素，不仅可以降低生产成本，同时可以避免制备泰乐菌素中醋酸丁酯等有机溶剂的使用，降低了环境污染，环保性高。但是，该方法在实际生产应用中是不理想的。泰乐菌素滤液不经过醋酸丁酯萃取纯化，泰乐菌素滤液的组分只有约83～85％，含量约9000～10000μg/ml，达不到泰万菌素发酵工艺需求标准，会造成转化生成的泰万菌素质量差，严重影响发酵最终的放罐水平。
技术实现思路
1、针对上述现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种在泰万菌素发酵中使用泰乐菌素精制液的方法。本发明先精制醋酸丁酯萃取纯化的泰乐菌素滤液得到泰乐菌素精制液，再将泰乐菌素精制液用于泰万菌素发酵。不仅避免了泰万菌素发酵中使用泰乐菌素成品的高成本，而且可实现泰万菌素发酵效价的提高，最终放罐效价可提高至35000μg/ml以上。为泰乐菌素与泰万菌素联动生产提供了新思路。
2、为了实现上述目的，本发明采取如下技术方案：
3、一种在泰万菌素发酵中使用泰乐菌素精制液的方法，包括如下步骤：
4、向泰万菌素的发酵罐中补充泰乐菌素精制液，所述泰乐菌素精制液的制备方法包括：
5、获取泰乐菌素成品的中间体——泰乐菌素滤液，经醋酸丁酯萃取纯化后，控制泰乐菌素滤液中有机溶剂残留符合要求：100μg/ml≤醋酸丁酯残留≤300μg/ml，200μg/ml≤乙酸+丁醇残留≤500μg/ml，再经灭菌处理，得到泰乐菌素精制液。
6、本发明中获取泰乐菌素滤液的方法为：泰乐菌素产生菌经液体发酵140-200小时后用酸调整发酵液ph为3.5-4.5使发酵液中的泰乐菌素成为强水溶性的泰乐菌素盐，再通过固液分离得到泰乐菌素滤液。泰乐菌素滤液经醋酸丁酯萃取纯化后，泰乐菌素组分达到90％以上，含量达200000ug/ml以上。
7、其中，控制泰乐菌素滤液中100μg/ml≤醋酸丁酯残留≤300μg/ml，200μg/ml≤乙酸+丁醇残留≤500μg/ml，再进行灭菌处理，得到泰乐菌素精制液，使用该料液经转化后得到的泰万发酵液发酵水平得到显著提高。当有机溶剂残留处于适当浓度范围内，有机溶剂可增大细胞膜通透性，有利于发酵液中有效物质的利用与产物分泌；而有机溶剂残留超过一定浓度，有机溶剂会抑制产泰万菌素的菌株转化甚至凋亡。
8、进一步，发酵罐内核酸量达到0.4g/l以上，采取流加的方式向泰万菌素的发酵罐中补充泰乐菌素精制液，根据泰万发酵水平实时调控泰乐菌素精制液的流加速率。
9、进一步，流加速率维持发酵液中5μg/ml≤醋酸丁酯残留≤21μg/ml，12μg/ml≤乙酸+丁醇残留≤35μg/ml。
10、通入无菌空气吹扫，使用活性炭滤芯过滤，可以控制泰乐菌素滤液中有机溶剂残留符合要求。其中，通入无菌空气吹扫，能控制泰乐菌素滤液中醋酸丁酯含量符合要求，具体地，控制滤液温度维持在0～6℃吹扫3小时，再升温至20℃吹扫3小时。其中，使用活性炭滤芯过滤，能控制泰乐菌素滤液中乙酸和丁醇总含量符合要求，具体地，控制滤液温度维持在20℃，膜面流速1.5m/s使用活性炭滤芯过滤。
11、其中，灭菌处理步骤为使用膜过滤或者水浴加热，过滤膜的孔径≤0.22μm，水浴温度≥80℃，保温时间≥30分钟。
12、具体地，一种在泰万菌素发酵中使用泰乐菌素精制液的方法，包括如下步骤：s1摇瓶种子的培养：将产泰万菌素的菌株接种到摇瓶种子液中培养；s2种子罐培养：将培养好的摇瓶种子液接种到种子罐培养基中培养；s3发酵罐培养：将培养好的种子罐中的种子培养基接种到发酵罐中培养，培养到发酵罐内生物量达到转化要求，向发酵罐中补充所述泰乐菌素精制液，代替泰乐菌素成品在泰万菌株发酵中进行转化，泰万菌素发酵最终放罐效价在35000μg/ml以上。
13、其中，步骤s1摇瓶种子的培养条件为：温度：30±3℃，周期：48±2小时，摇床转速220±20rpm；
14、其中，步骤s2种子罐的培养条件为：温度：30±3℃，周期：24±2小时；
15、其中，步骤s3发酵罐的培养条件为：温度：30±3℃，周期：190±10小时；
16、其中，步骤s3中，培养到发酵罐内核酸量达到0.4g/l以上，采取流加的方式向发酵罐中补充步骤(1)得到的泰乐菌素精制液，流加速率需维持发酵液中5μg/ml≤醋酸丁酯残留≤21μg/ml，12μg/ml≤乙酸+丁醇残留≤35μg/ml。
17、与现有技术相比，本发明具有如下优点及有益效果：
18、1、本发明将醋酸丁酯萃取纯化的泰乐菌素滤液精制后替代泰乐菌素成品用于泰万菌素的发酵，经过醋酸丁酯萃取纯化后的泰乐菌素滤液组分达到90％以上，含量达200000ug/ml以上，能够最优满足泰万菌素发酵的需求，制备质量好的泰万菌素。本发明避免使用泰乐菌素成品，降低了泰万菌素发酵中溶解泰乐菌素成品的复杂性。
19、2、本发明控制泰乐菌素滤液中有机溶剂残留得到泰乐菌素精制液，用于泰万菌素发酵，可以将泰万菌素发酵最终放罐效价提高至35000μg/ml以上。泰万菌素是胞外产物，适当含量的有机溶剂可以增大细胞膜通透性，利于细胞对发酵液中有效物质的利用与产物的分泌，对有机溶剂残留的控制与灭菌处理，在提高细胞膜通透性的前提下，防止有机溶剂残留量过高，超过菌株耐受程度，造成转化能力的影响甚至凋亡，控制全程无菌防止发酵过程中染菌导致发酵液中营养成分的缺失，杂菌的产物会改变发酵罐内环境，影响泰万菌素的转化。
20、3、本发明在泰万菌素发酵中使用含低浓度有机溶剂的泰乐菌素精制液，其发酵水平较使用泰乐菌素成品的发酵水平提高3000μg/ml以上，为泰乐菌素与泰万菌素联动生产提供了新思路，能有效地降低生产成本。
1.一种在泰万菌素发酵中使用泰乐菌素精制液的方法，其特征在于，包括如下步骤：向泰万菌素的发酵罐中补充泰乐菌素精制液，所述泰乐菌素精制液的制备方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵罐内核酸量达到0.4g/l以上，采取流加的方式向泰万菌素的发酵罐中补充泰乐菌素精制液，优选的，流加速率维持发酵液中5μg/ml≤醋酸丁酯残留≤21μg/ml，12μg/ml≤乙酸+丁醇残留≤35μg/ml。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，泰乐菌素滤液经醋酸丁酯萃取纯化后，泰乐菌素组分达到90％以上，含量达200000ug/ml以上。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通入无菌空气吹扫，使用活性炭滤芯过滤，控制泰乐菌素滤液中有机溶剂残留符合要求。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，通入无菌空气吹扫具体为：控制滤液温度维持在0～6℃吹扫3小时，再升温至20℃吹扫3小时，和/或
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，灭菌处理步骤为使用膜过滤或者水浴加热，过滤膜的孔径≤0.22μm，水浴温度≥80℃，保温时间≥30分钟。
7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：s1摇瓶种子的培养：将产泰万菌素的菌株接种到摇瓶种子液中培养；s2种子罐培养：将培养好的摇瓶种子液接种到种子罐培养基中培养；s3发酵罐培养：将培养好的种子罐中的种子培养基接种到发酵罐中培养，培养到发酵罐内生物量达到转化要求，向发酵罐中补充权利要求1-6任一所述的方法中的泰乐菌素精制液，代替泰乐菌素成品在泰万菌株发酵中进行转化。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤s3中，培养到发酵罐内核酸量达到0.4g/l以上，采取流加的方式向发酵罐中补充所述的泰乐菌素精制液，优选的，流加速率维持发酵液中5μg/ml≤醋酸丁酯残留≤21μg/ml，12μg/ml≤乙酸+丁醇残留≤35μg/ml。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤s1摇瓶种子的培养条件为：温度：30±3℃，周期：48±2小时，摇床转速220±20rpm；
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，泰万菌素发酵最终放罐效价在35000μg/ml以上。
