pH响应性蛋白高分子两亲体的制备及其应用

ph响应性蛋白高分子两亲体的制备及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物医用材料领域，具体地，本发明涉及ph响应性蛋白高分子两亲体的制备及其应用。


背景技术：

2.蛋白自组装体已经作为一种重要的生物材料广泛应用于药物递送、肿瘤诊疗等领域。将蛋白质和疏水高分子连接在一起形成蛋白高分子两亲体，可以自组装成不同形貌的纳米颗粒。
3.小分子药物和蛋白质药物都存在稳定性差、半衰期短和靶向性差的问题，制约了其在肿瘤诊疗中的应用。
4.肿瘤组织中，活跃的糖酵解产生大量乳酸，相比较正常组织的弱碱性的胞外ph值，肿瘤的胞外ph呈酸性，约6.5。
5.因此，利用肿瘤酸性微环境，研制具有ph响应性的药物递送系统尤为重要。


技术实现要素：

6.本技术是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识做出的：
7.小分子药物和蛋白质药物的稳定性差、半衰期短和靶向性差，制约了其应用，基于上述问题的发现，发明人开发了一种具有ph响应性的蛋白质-高分子两亲体及其制备方法，该制备方法操作简单，收率高，且该蛋白质-高分子两亲体具有靶向性，能对特定ph产生高敏反应。利用该蛋白质-高分子两亲体，一方面可以作为化疗药物或诊断试剂的递送载体，提高小分子药物的靶向性，降低其副作用；另一方面蛋白质本身可以选择一些药用蛋白，借助ph响应性的高分子的靶向作用，可提高药用蛋白稳定性及其靶向性，有望极大拓展蛋白质药物在肿瘤诊疗中的应用。
8.在本发明的第一方面，本发明提出了一种制备蛋白质-高分子两亲体的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：(1)将引发剂与蛋白质进行共价连接，以便获得蛋白质-引发剂结合体；(2)将所述蛋白质-引发剂结合体与单体化合物进行原位聚合，以便获得蛋白质-高分子两亲体，所述高分子在ph5～10范围内具有ph响应性，所述高分子pka为5-10。需要说明的是，原位聚合可利用原子转移自由基聚合方法(atrp)或者可逆加成断裂链转移聚合方法(raft)实现。根据本发明实施例的方法，整个聚合反应在水溶液中反应，有效避免了蛋白质与有机溶剂的接触，从而保证了蛋白质的活性。此外，发明人成功地将具有ph响应性的高分子与蛋白质结合，所形成的蛋白质-高分子两亲体具有了更加灵敏的ph响应性，在周围环境ph》两亲体pka条件下以胶束形式存在，在周围环境ph《两亲体pka条件下会解聚。根据本发明实施例的上述方法获得的蛋白质-高分子两亲体对于肿瘤微环境尤其敏感，肿瘤微环境的ph小于根据本发明实施例的蛋白质-高分子两亲体的pka，因而，利用根据本发明实施例的上述方法获得的蛋白质-高分子两亲体具有靶向肿瘤而解体的功效，实现了蛋白质药物或其他可包载分子在肿瘤的定点释放。根据本发明实施例的方法操作简单，收率高，
同时根据本发明实施例的方法制备得到的蛋白质-高分子两亲体具有ph高响应性，尤其是对于肿瘤微环境具有更加灵敏的响应，且获得的蛋白质-高分子两亲体的蛋白活性高、化学结构明确、入胞效果好、生物安全性高。
9.根据本发明的实施例，上述方法进一步包括如下附加技术特征至少之一：
10.根据本发明的实施例，所述引发剂包括原子转移自由基聚合反应的引发剂、可逆加成-断裂链转移聚合的链转移试剂。
11.根据本发明的实施例，所述原子转移自由基聚合的引发剂包括选自多卤化物、卤代酯类、卤代酮类、卤代腈类的至少之一。
12.根据本发明的实施例，所述可逆加成-断裂链转移聚合的引发剂包括选自硫代羰基硫基类和硫代膦基硫基类化合物。
13.根据本发明的实施例，所述可逆加成-断裂链转移聚合的链转移试剂引发剂包括选自二硫代酯、二硫代氨基甲酸酯、黄原酸酯、三硫代碳酸酯的至少之一。
14.根据本发明的实施例，所述蛋白质与所述引发剂经过共价键连接的，所述共价键连接的位点在所述蛋白质的n-或c-端及其它任何远离所述蛋白质的活性的位点和/或不干扰所述蛋白质的活性的位点。进而所获得的蛋白质-引发剂结合体性质稳定，而不会破坏蛋白质的活性。
15.根据本发明的实施例，所述蛋白质包括医药、农业、科研以及其它工业领域相关的蛋白、小肽和抗体，特别包括治疗性蛋白如胰岛素，单克隆抗体，血液因子，集落刺激因子，生长激素，白介素，生长因子，治疗性疫苗，降钙素，肿瘤坏死因子(tnf)和酶等。具体的例子包括，但不限于：天冬酰胺酶、谷氨酸酶、精氨酸酶、精氨酸脱氨酶、腺苷脱氨酶核糖核酸酶、胞嘧啶脱氨酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶，表皮生长因子(egf)、胰岛素样生长因子(igf)、转化生长因子(tgf)、神经生长因子(ngf)、血小板衍生的生长因子(pdgf)，骨形态发生蛋白(bmp)，成纤维细胞生长因子、生长抑素、生长激素、生长激素、生长激素抑制素、降钙素、甲状旁腺激素、集落刺激因子(csf)、凝血因子、肿瘤坏死因素、干扰素、白细胞介素、胃肠肽、血管活性肠肽(vip)、肠促胰酶肽(cck)，胃泌素，促胰液素、促红细胞生成素、荷尔蒙、抗利尿激素、奥曲肽、胰腺酶、超氧化物歧化酶、促甲状腺激素释放激素(trh)、促甲状腺激素、促黄体生成激素、促黄体激素释放激素(lhrh)、组织型纤溶酶原激活剂、白细胞介素-1、白细胞介素-15、受体拮抗剂(il-1ra)、胰高血糖素样肽-1(glp-1)、瘦素、生长素、粒单核细胞集落刺激因子(gm-csf)、白细胞介素-2(il-2)、腺苷脱氨酶、尿酸酶、天冬酰胺酶、人生长激素、天冬酰胺酶、巨噬细胞活化、绒毛膜促性腺激素、肝素、心房利钠肽、血红蛋白、逆转录病毒载体、松弛肽、环孢菌素、催产素、疫苗、单克隆抗体、单链抗体、锚蛋白重复蛋白、亲和体等。
16.根据本发明的具体实施例，所述蛋白质为人血清白蛋白。进而可采用一系列药用蛋白；
17.根据本发明的实施例，所述连接位点为人血清白蛋白上的34位半胱氨酸。
18.所述引发剂为式(i)所示化合物
[0019][0020]
根据本发明的实施例，将预先溶于缓冲溶液中的所述蛋白质与所述引发剂在室温条件下反应5分钟-24小时。
[0021]
根据本发明的实施例，所述蛋白质与所述引发剂的偶联比是1:1。根据本发明的具体实施例，在hsa的34位半胱氨酸上修饰，人血清白蛋白只有一个游离的半胱氨酸，蛋白质与引发剂可以实现1：1的偶联比，进而实现定点修饰，保证了产品化学结构明确和产品均一性。
[0022]
根据本发明的具体实施例，所述原位聚合为原子转移自由基聚合反应。
[0023]
根据本发明的实施例，所述原位聚合是在低氧或者惰性气体氛围下、温度为0-80℃的条件下进行5分钟～24小时。进而聚合反应得到高分子分子量分布窄，聚合效率高。
[0024]
根据本发明的实施例，所述原位聚合包括原子转移自由基聚合和可逆加成-断裂链转移聚合。
[0025]
根据本发明的实施例，所述原子转移自由基聚合是在铜及配体的催化下进行的，所述铜是以cucl、cucl2、cubr、cubr2的形式提供的，所述配体为含氮类络合剂。
[0026]
根据本发明的实施例，所述配体为2,2-联吡啶、五甲基二乙烯三胺、三(2-二甲氨基乙基)胺或1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺。
[0027]
根据本发明的实施例，所述原位聚合是在cucl以及1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺的催化下进行的。进而原位结合的效率进一步提高。
[0028]
根据本发明的实施例，所述蛋白质-引发剂结合体、所述单体化合物、所述cucl、所述1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺的摩尔比为1:(200-3000):(10-500):(10-4000)。进而原位聚合的效率进一步提高。
[0029]
根据本发明的实施例，所述蛋白质-引发剂结合体、所述单体化合物、所述cucl、所述1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺的摩尔比为1:500:40:100。进而原位聚合的效率进一步提高。
[0030]
根据本发明的实施例，所述单体化合物具有式(ii)所示的结构：
[0031][0032]
其中，r为上述单体化合物与蛋白质结合形成的蛋白质-高分子两亲体具有ph响应性。
[0033]
根据本发明的具体实施例，所述单体化合物为2-(二异丙基氨基)甲基丙烯酸乙酯(dpa)。进而所获得蛋白质-高分子两亲体的ph响应性的灵敏度进一步提高。
[0034]
在本发明的第二方面，本发明提出了一种蛋白质-高分子两亲体。根据本发明的实施例，所述蛋白质-高分子两亲体是根据前面所述的方法获得的。根据本发明实施例的蛋白质-高分子两亲体具有更加灵敏的ph响应性，即在ph》pka条件下以胶束形式存在，在ph《pka条件下会解聚。根据本发明实施例的蛋白质-高分子两亲体对于肿瘤微环境尤其敏感，肿瘤微环境的ph小于根据本发明实施例的蛋白质-高分子两亲体的pka，因而，根据本发明实施例的蛋白质-高分子两亲体具有靶向肿瘤而解体的功效，实现了蛋白质药物或其他可包载分子在肿瘤的定点释放。且根据本发明实施例的蛋白质-高分子两亲体结构明确、产品均一性好、生物安全性高、蛋白活性高。
[0035]
在本发明的第三方面，本发明提出了一种蛋白质-高分子两亲体。根据本发明的实施例，所述蛋白质-高分子两亲体包括：亲水区，所述亲水区包含蛋白质；以及疏水区，所述疏水区包含高分子，所述高分子在ph5～10范围内具有ph响应性，所述高分子pka在5-10之间。根据本发明实施例的蛋白质-高分子两亲体具有更加灵敏的ph响应性，即在ph》pka条件下以胶束形式存在，在ph《pka条件下会解聚。根据本发明实施例的蛋白质-高分子两亲体对于肿瘤微环境尤其敏感，肿瘤微环境的ph小于根据本发明实施例的蛋白质-高分子两亲体的pka，因而根据本发明实施例的蛋白质-高分子两亲体具有靶向肿瘤而解体的功效，实现了蛋白质药物或其他可包载分子在肿瘤的定点释放。且根据本发明实施例的蛋白质-高分子两亲体结构明确、产品均一性好、生物安全性高、蛋白活性高。
[0036]
在本发明的第四方面，本发明提出了一种纳米颗粒。根据本发明的实施例，所述纳米颗粒由前面所述的蛋白质-高分子自组装形成，包括：疏水核心，所述疏水核心由所述蛋白质-高分子两亲体的疏水区构成；以及亲水外壳，所述亲水外壳设置所述疏水核心的外表面，由所述蛋白质-高分子两亲体的亲水区构成。根据本发明实施例的纳米颗粒具有ph响应性，在ph》pka条件下以胶束形式存在，在ph《pka条件下会解聚。根据本发明实施例的纳米颗粒对于肿瘤微环境尤其敏感，肿瘤微环境的ph小于根据本发明实施例的纳米颗粒的pka，因而，根据本发明实施例的纳米颗粒具有靶向肿瘤而解体的功效，实现了蛋白质药物或其他可包载分子在肿瘤的定点释放。且根据本发明实施例的纳米颗粒容易进入细胞、生物安全性高、蛋白活性高、包载率高、载药量高。
[0037]
根据本发明的实施例，上述纳米颗粒进一步包括如下附加技术特征至少之一：
[0038]
根据本发明的实施例，进一步包括装载化合物。所述装载方式为化学偶联或物理包埋，即可将小分子化合物通过化学键连接在高分子上，也可通过简单物理吸附的方式装载在胶束内核里。根据本发明的具体实施例中采用的是物理包埋方式。根据本发明实施例的蛋白质-高分子两亲体与待包载的化合物在缓冲液中，通过亲疏水作用，能将化合物包载在纳米颗粒的核心。包载化合物后的纳米颗粒在一定的ph条件，如血液循环中以胶束形式存在，在另一些ph条件下，如肿瘤微酸性环境下，发生解聚，释放出包载的化合物，实现靶向解体，将包载的化合物定点释放在靶向位置。根据本发明实施例的纳米颗粒靶向性好，包载率高且载药量高。
[0039]
根据本发明的实施例，所述化合物包括疏水性的小分子药物和荧光分子。例如，小分子药物可以为化疗药物。
[0040]
根据本发明的实施例，所述小分子药物包括选自吉西他滨、紫杉醇、阿霉素、吉非替尼、甲氨蝶呤中的至少之一。小分子药物多数为化疗药物，包载上述小分子药物的纳米颗
粒，在ph》pka条件下，如血液循环中，以胶束形式存在，在ph《pka条件下，如肿瘤微酸性环境下，发生解聚，释放出包载的小分子药物，进而实现小分子药物的靶向递送。
[0041]
根据本发明的实施例，所述荧光分子包括选自磺酰罗丹明b、吲哚菁绿、异硫氰酸荧光素、溴化乙锭、水溶性荧光蓝、茶酐类水溶性荧光染料、水溶性菁染料琥珀酰亚胺酯类染料、藻红蛋白香豆素、细胞膜红色荧光探针、罗丹明200以及荧光素酯中的至少之一。包载上述荧光分子的纳米颗粒，在ph》pka条件下，如血液循环中，以胶束形式存在，在ph《pka条件下，如肿瘤微酸性环境下，发生解聚，释放出包载的荧光分子，进而实现活体肿瘤中成像。
[0042]
根据本发明的实施例，所述化合物为吲哚菁绿。吲哚菁绿是目前唯一被食品药品监督管理局批准的临床使用的近红外成像造影剂，但是吲哚菁绿的半衰期短、靶向性差，制约了其在肿瘤成像领域的使用。利用上述纳米颗粒包载吲哚菁绿后，在血液循环中，以胶束形式存在，而在肿瘤微环境下胶束解聚，释放出吲哚菁绿，实现了吲哚菁绿的靶向性释放，提高了吲哚菁绿的半衰期。
[0043]
在本发明的第五方面，本发明提出了一种制备纳米探针的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括将前面所述的蛋白质-高分子两亲体与待包载荧光分子进行接触，以便获得所述纳米探针。蛋白质-高分子两亲体通过亲疏水作用将待包载化合物包载在蛋白质-高分子两亲体的胶束中间。根据发明实施例的方法，蛋白质-高分子两亲体的包载率高、载药量高。
[0044]
根据本发明的实施例，上述方法进一步包括如下附加技术特征至少之一：
[0045]
根据本发明的实施例，所述待包载荧光分子包括选自磺酰罗丹明b、吲哚菁绿、异硫氰酸荧光素、溴化乙锭、水溶性荧光蓝、茶酐类水溶性荧光染料、水溶性菁染料琥珀酰亚胺酯类染料、藻红蛋白香豆素、细胞膜红色荧光探针、罗丹明200以及荧光素酯中的至少之一。
[0046]
根据本发明的实施例，所述接触是在室温、暗处理条件下进行5分钟～24小时。进而避免了荧光淬灭，包载率进一步提高。
[0047]
根据本发明的实施例，所述蛋白质-高分子两亲体和所述待包载荧光分子的摩尔比为1:(0.5-20)。发明人发现，在上述摩尔比的条件下，蛋白质-高分子两亲体的包载率高、载药量高。
[0048]
在本发明的第六方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物包括前面所述的蛋白质-高分子两亲体或包括前面所述的纳米颗粒，所述蛋白质-高分子两亲体和/或所述纳米颗粒包载的分子和/或蛋白质为药物分子。根据本发明实施例的药物组合物可以靶向递送化疗药物或诊断试剂，提高小分子药物的靶向性，降低其副作用；同时蛋白质本身可以选择一些药用蛋白，借助ph响应性的高分子的靶向作用，可提高药用蛋白稳定性及其靶向性，有望极大拓展蛋白质药物在肿瘤诊疗中的应用。
[0049]
在本发明的第七方面，本发明提出了一种荧光成像方法。根据本发明的实施例，将前面所述的蛋白质-高分子两亲体或包括前面所述的纳米颗粒导入待成像微环境中，所述蛋白质-高分子两亲体和/或纳米颗粒包载的分子为荧光分子。需要说明的是，所述成像微环境既包括离体的细胞和组织，也包括活体的细胞和组织。根据本发明实施例的方法，所述蛋白质-高分子两亲体或纳米颗粒导入成像微环境后，在ph《pka条件下，蛋白质-高分子两亲体或纳米颗粒发生解聚，释放出荧光分子，进而在微环境中成像。
[0050]
在本发明的再一方面，本发明提出了一种合成ph响应性蛋白高分子两亲体以及包载化合物的方法以及表征的一般方法。根据本发明的具体实施例，方法包括：
[0051]
(1)蛋白质-引发剂结合体人血清白蛋白(hsa)-含溴引发剂(br)的合成：首先合成引发剂，然后将引发剂与hsa共价连接。
[0052]
其中，以引发剂ebmp为例，引发剂合成路线如下：
[0053][0054]
(2)ph响应性蛋白-高分子两亲体hsa-pdpa的合成：以蛋白质-引发剂结合体hsa-br进行引发，利用原子转移自由基聚合的方法，聚合dpa单体而形成蛋白-高分子两亲体hsa-pdpa；
[0055]
(3)包载吲哚菁绿(icg)形成hsa-pdpa/icg(hdi)纳米探针：将icg溶在少量dmso中，直接滴入到hsa-pdpa的pbs溶液中，利用亲疏水作用，icg会被包载入hsa-pdpa胶束内核中，形成hsa-pdpa/icg纳米探针；
[0056]
(4)利用凝胶渗透色谱(gpc)、酶标仪、动态光散射(dls)和透射电镜(tem)等分析手段表征hsa-pdpa和hsa-pdpa/icg的分子量、半径、吸收光谱和荧光光谱等一系列理化性质；
[0057]
(5)选c8161细胞系测试hsa-pdpa/icg的入胞情况，选用c8161、l929、mcf-10和hemc细胞系测试hsa-pdpa纳米颗粒的细胞毒性；
[0058]
(6)建立裸鼠肿瘤模型，测试hsa-pdpa/icg的肿瘤成像效果和药物分布。
附图说明
[0059]
图1是根据本发明实施例的ph响应性两亲体hsa-pdpa的合成路线及其应用示意图；
[0060]
图2是根据本发明实施例的hsa-pdpa提纯前后sds-page胶图结果；
[0061]
图3是根据本发明实施例的水解后pdpa的gpc图；
[0062]
图4是根据本发明实施例的水解后phpma的gpc图；
[0063]
图5是根据本发明实施例的hsa-pdpa和hdi的理化性质表征；
[0064]
图6是根据本发明实施例的hsa-phpma和hhi的形貌表征；
[0065]
图7是根据本发明实施例的hsa-phpma和hhi的ph响应性表征；
[0066]
图8是根据本发明实施例的hsa-pdpa和hsa-phpma的临界胶束浓度；
[0067]
图9是根据本发明实施例的hdi的ph响应性的光学性质表征；
[0068]
图10是根据本发明实施例的hdi、hhi在不同ph下的入胞效果；
[0069]
图11是根据本发明实施例的hsa-pdpa的生物安全性表征；以及
[0070]
图12是根据本发明实施例的hsa-pdpa/icg的活体肿瘤成像效果和生物分布。
具体实施方式
[0071]
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0072]
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0073]
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0074]
下述实施例中的c8161黑色素瘤细胞(已转染绿色荧光蛋白gfp)由军事医学科学院赠予，l929、hemc和mcf-10均购自中国科学院肿瘤细胞库。
[0075]
下述实施例中的细胞培养基为gibco公司产品。
[0076]
下述实施例中的雌性无胸腺(nude)裸鼠为北京维通利华实验动物技术有限公司产品。雌性无胸腺(nude)裸鼠在下文中简称裸鼠。
[0077]
下述实施例中，利用sds-page定性分析atrp聚合及产物纯化效果；利用凝胶渗透色谱(gpc)定量分析产物的分子量；利用透射电子显微镜(tem)观测不同ph或不同分子量下hsa-pdpa/icg的形貌；利用动态光散射粒度仪(dls)测量不同ph下粒径和zeta电位的变化；利用酶标仪测量不同ph下，hsa-pdpa/icg的荧光特性的变化。利用细胞内吞实验和细胞毒性实验测试hsa-pdpa/icg的入胞效果和hsa-pdpa的生物安全性；建立裸鼠肿瘤模型，测试hsa-pdpa/icg的肿瘤成像效果和生物分布。
[0078]
下述实施例中的定量实验，如无特殊说明均设置三次重复,结果取平均值。
[0079]
实施例1制备ph响应性蛋白质-高分子两亲体hsa-pdpa的方法
[0080]
一、制备大分子原子转移自由基聚合反应的引发剂hsa-br
[0081]
1)小分子引发剂ebmp的合成
[0082]
首先马来酰亚胺和四乙二醇通过光延反应得到马来酰亚胺四乙二醇，再与溴异丁酰溴发生酯化反应，便得到了小分子引发剂ebmp，产率54％。1h nmr(400mhz,cdcl3):δ6.702(s,2h),4.324(m,2h),3.604-3.749(m,14h),1.938(s,6h).esi-mass m/z:444.1([m+na]
+
),446.1([m+na]
+
).
[0083][0084]
2)hsa-br的合成
[0085]
取人血清白蛋白hsa(2ml,100μm)溶于tris-hcl缓冲液中，利用hsa上34位半胱氨酸的游离巯基，加入巯基修饰引发剂ebmp(20μl,50mm)，混匀后放置室温下继续反应3小时。反应结束后用0.22μm滤膜过滤，用akta蛋白纯化仪脱盐，弃去残余的ebmp，得到纯化的连有引发剂的人血清白蛋白(hsa-br)，修饰效率45％。
[0086]
二、ph响应性蛋白质-高分子两亲体hsa-pdpa的合成
[0087]
取1ml上一步得到的50μm hsa-br溶液，加入单体dpa(200-4000倍当量)，在反应管中通n2磁力搅拌30min除去体系中的氧气。另一容器中加入cucl粉末(40倍当量)，以及hmteta(100倍当量)，同样通n2磁力搅拌30min后将其注入反应管中，密闭条件下反应过夜，然后暴露在空气中终止反应，得到反应混合物。
[0088]
反应混合物经透析除去未反应的单体和催化剂，然后经分子筛(hiload 26/
600superdex75pg，ge healthcare)分离提纯出hsa-pdpa，产率70％，纯化采用的缓冲液为10mm pbs，ph 7.4。
[0089]
实施例2制备无ph响应性蛋白质-高分子两亲体hsa-phpma的方法
[0090]
与实施例1同样的步骤合成没有ph响应性的人血清白蛋白-聚甲基丙烯酸羟丙酯(hsa-phpma)作为对照，具体如下所述：
[0091]
取1ml上一步得到的50μm hsa-br溶液，加入单体hpma(200-4000倍当量)，在反应管中通n2磁力搅拌30min除去体系中的氧气。另一容器中加入cucl粉末(40倍当量)，以及hmteta(100倍当量)，同样通n2磁力搅拌30min后将其注入反应管中，密闭条件下反应过夜，然后暴露在空气中终止反应，得到反应混合物。
[0092]
反应混合物经透析除去未反应的单体和催化剂，然后经分子筛(hiload 26/600 superdex75pg，ge healthcare)分离提纯出hsa-phpma，产率75％，纯化采用的缓冲液为10mm pbs，ph 7.4。
[0093]
实施例3利用ph响应性hsa-pdpa包载吲哚菁绿
[0094]
将0.38mg的吲哚菁绿溶在dmso中，然后将其滴加到1ml 5mg/ml的上述hsa-dpa溶液中，溶液在室温暗处反应过夜，产物通过透析除去dmso和游离的icg，从而得到包载好的hsa-pdpa/icg(hdi)荧光探针。
[0095]
同样的步骤合成得到hsa-phpma/icg(hhi)荧光探针作为对照。
[0096]
实施例4 hsa-pdpa的物理化学表征
[0097]
利用sds-page表征hsa-pdpa的聚合和提纯，图2显示了sds-page结果，甬道1是蛋白标样，甬道2是hsa-br，甬道3是未提纯的hsa-pdpa，甬道4是提纯后的hsa-pdpa，相比于hsa-br，看出甬道3、4有一条弥散带出现证明聚合成功，甬道4与甬道3相比，表明未聚合的hsa-br和单体已成功从产物中提纯出去。
[0098]
利用凝胶渗透色谱(gpc)测定hsa-pdpa中高分子链段的分子量，测分子量前需要将hsa-pdpa中的蛋白水解掉，方法如下：将12mg的hsa-pdpa放在水解管里，同时加入3ml 6m盐酸，抽真空后在110℃中反应过夜，反应结束后通过透析得到断裂下来的高分子，用gpc准备表征其分子量，结果如图3所示，得到数均分子量为10.1kda，分子量分布为1.68。
[0099]
同样的步骤用gpc测定对照组hsa-phpma中高分子链段的分子量，得到数均分子量为40kda，分子量分布1.2，结果如图4所示。
[0100]
在malvern zetasizer nano-zs90上用动态光散射(dls)方法测定hsa-pdpa和hsa-pdpa/icg的水合半径和zeta电位。样品稀释在pbs缓冲液中，测试前经0.22μm孔径滤膜过滤处理。经dls测试，hsa-pdpa的水合直径为92nm，包载icg后的hsa-pdpa/icg的水合直径为101nm。图5a显示了dls结果。用透射电子显微镜(tem)来观察蛋白纳米颗粒形貌。将蛋白稀释到0.1mg/ml，滴到碳元素覆盖的铜网上，静置5min，之后吸取溶液，用2％(w/v)磷钨酸溶液进行染色，室温晾干，之后用hitachi h-7650b透射电子显微镜来观测样品。tem显示hsa-pdpa和hsa-pdpa/icg纳米颗粒直径均约为30nm，图5b显示了tem结果。为表征样品的ph响应性，将hsa-pdpa和hdi溶解在不同ph的缓冲液中，用dls测定其水合半径和zeta电位，图5c和图5d显示了，在ph由6.6变为6.4时，hsa-pdpa和hdi水合半径由约86nm和约120nm变为约10nm，相应的，zeta电位也由负变为正，这表明pdpa发生质子化，由疏水变为亲水，导致胶束发生解体，同时由于质子化体系zeta电位变为正电。图6显示通过dls测得hsa-phpma和
hhi的水合直径分布为81nm和82nm,tem显示hsa-phpma和hhi的形貌为胶束，直径分别为51.6
±
6.8nm和50.88
±
9.9nm。图7显示通过dls测定不同ph下的粒径表明hsa-phpma和hhi无ph响应性。
[0101]
根据本发明实施例可知，pdpa的pka约为6.5，hsa-pdpa的pka也为6.5。hsa-phpma其在ph5-8之间无ph响应性。
[0102]
用尼罗红染色方法测定hsa-pdpa和hsa-phpma最大胶束临界浓度。将尼罗红染料溶于pbs中，使其终浓度为1.25μm，然后将样品与尼罗红从8.3μm到0.03μm 1:1倍比稀释。之后用激发光550nm，发射光630nm在spectramax m3 microplate reader(molecular devices)酶标仪上测定荧光强度。图8显示了hsa-pdpa和hsa-phpma最低胶束临界浓度约为0.5μm和0.1μm。
[0103]
测定hsa-pdpa的包封率和载药量，icg浓度icg的标准曲线来确定，hsa的浓度通过bca来确定。icg标准曲线建立的具体步骤如下：首先用含30％血清的pbs制备一系列浓度的icg溶液，用酶标仪测量其在805nm处的吸光度，以浓度为纵轴，吸光度为横轴作出标准曲线。包封率定义为装载在胶束中icg的质量与起始的加入icg质量的比值，载药量定义为装载在胶束中icg的质量与体系总质量的比值。表1显示了其测定结果，通过其稳定性，我们筛选出icg:hsa＝1:5的投料比来进行后续实验。
[0104]
表1
[0105][0106]
用酶标仪测定不同ph的pbs缓冲液中hsa-pdpa/icg的荧光曲线和吸收曲线，所有样品包含10μg/ml icg。图9a显示了icg、hsa-icg和hdi在ph 7.4或6.4下的吸收光谱，结果显示hdi的最大吸收峰(807nm)远大于hsa-icg(798nm)和icg(774)，这表明icg大多数装载进了hsa-pdpa的胶束内核，其结构如图9b所示。从而由于聚集诱导淬灭效应，使得hdi的荧光发生淬灭，而icg和hhi却没有，如图9c所示。当ph由6.6变为6.4后，如图9d荧光光谱所示，hdi的荧光强度突然增大，而对于icg和hhi在ph5.5-7.4的范围内，以740nm的激发波长激发其在810nm下的荧光强度几乎没有变化。这也说明hsa-pdpa的ph响应性对icg的荧光性能也带来了ph响应性。
[0107]
实施例5 hsa-pdpa的生物安全性和入胞效果
[0108]
选用转染绿色荧光蛋白(gfp)的c8161黑色素瘤细胞测定包载icg的hsa-pdpa的入胞效果。将细胞在含有10％fbs、50u/ml盘尼西林和50μg/ml链霉素的dmem/f-12中培养一段时间后，在35mm玻底培养皿中接种一定浓度的细胞悬浮液(50000个细胞)，将在ph7.4和ph6.4下的hsa-pdpa/icg样品(20μg/ml icg)加入到细胞中培养30min。之后弃去培养液，用
预冷pbs洗2次，然后用4％多聚甲醛固定，然后再用pbs清洗，用200μl hoechest染核，然后再用pbs清洗，用lsm710激光扫描共聚焦显微镜(carl zeiss)观测，hoechst、gfp和icg的激发发射波长设定为346/460nm、488/544nm和633/664nm。为了进一步确定，将c8161接种在6孔板内，同样加入不同ph相同icg浓度的hsa-pdpa/icg培养半小时，收集细胞，然后通过bd facs aria iii流式细胞仪分析测定。结果如图10所示，共聚焦显微镜和流式细胞仪都表明，hhi在ph7.4和6.4的条件下入胞效果没有变化，而hdi在酸性条件下，由于hsa-pdpa质子化变为正电，可通过静电作用吸附到细胞表面从而更容易入胞，其在ph 6.4的条件下胞内荧光强度是hhi的七倍。
[0109]
hsa-pdpa的生物安全性通过mtt测定。选用c8161、l929、mcf-10a和hmecs细胞系。将细胞在含有10％fbs、50u/ml盘尼西林和50μg/ml链霉素的dmem/f-12(l929和mcf-10a用dmem,hmecs用rpmi-1640)中培养一段时间后，将细胞稀释加入96孔培养板中(20μl，5000个每孔)，设阴性对照(不含hsa-pdpa)和空白对照(只含培养液)，37℃，5％co2培养48h，加mtt溶解液(promega)20μl/孔，3h后用酶标仪测定各孔490nm波长的吸收值，比较不同样品处理后细胞增值的程度。图11显示在蛋白浓度300μg/ml以下，hsa-pdpa具有良好的生物安全性。
[0110]
实施例6 hsa-pdpa的肿瘤靶向递送效果及生物分布测试
[0111]
以下所有动物实验均在清华大学关于动物实验的各项规定指导下完成。本发明中利用babl/c无胸腺雌性裸鼠模型建立c8161黑色素瘤肿瘤模型，当肿瘤生长到150-200mm3时，小鼠随机分成三组，分别注射1.5mg/kg的icg、无ph响应性的hsa-phpma/icg和hsa-pdpa/icg，用ivis luminaⅱ活体成像系统(perkinelmer)采集在1、8、24和32h的荧光图像，之后将小鼠解剖，取心肝脾肺肾和肿瘤测定其荧光强度。结果如图12所示，注射1h后荧光遍布全身，并主要集中在肝脏，8h后由于增强渗透滞留效应(epr)，hhi和hdi纳米探针开始累积到肿瘤上。在24小时和32小时，只有hdi在肿瘤部位有很强的荧光，解剖出的肿瘤荧光强度是对照组hhi的3倍，icg的6倍有，这些结果表明hdi可以对肿瘤酸性微环境产生响应，从而有利于其肿瘤成像。
[0112]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
[0113]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

技术特征：
1.一种制备蛋白质-高分子两亲体的方法，其特征在于，包括：在水溶液中，(1)将引发剂与蛋白质进行共价连接，以便获得蛋白质-引发剂结合体；(2)将所述蛋白质-引发剂结合体与单体化合物进行原位聚合，所述单体化合物为2-(二异丙基氨基)甲基丙烯酸乙酯，以便获得蛋白质-高分子两亲体，所述高分子在ph5～10范围内具有ph响应性，所述高分子pka在5-10；所述原位聚合是在是在低氧或者惰性气体氛围下、温度为0-80℃、磁力搅拌的条件下进行5分钟～24小时；所述原位聚合是在cucl以及1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺的催化下进行的；所述蛋白质-引发剂结合体、所述单体化合物、所述cucl、所述1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺的摩尔比为1:(200-3000):(10-500):(10-4000)。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述引发剂包括原子转移自由基聚合反应的引发剂、可逆加成-断裂链转移聚合的引发剂。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述原子转移自由基聚合的引发剂包括选自多卤化物、卤代酯类、卤代酮类以及卤代腈类的至少之一。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述可逆加成-断裂链转移聚合的引发剂包括选自硫代羰基硫基类和硫代膦基硫基类化合物的至少之一。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述可逆加成-断裂链转移聚合的引发剂包括选自二硫代酯、二硫代氨基甲酸酯、黄原酸酯、三硫代碳酸酯的至少之一。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白质与所述引发剂通过共价键连接，所述共价键连接的位点在所述蛋白质的n-或c-端及其它任何远离所述蛋白质的活性的位点和/或不干扰所述蛋白质的活性的位点。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白质包括治疗性蛋白、单克隆抗体、血液因子、集落刺激因子、生长激素、白介素、生长因子、治疗性疫苗、降钙素、肿瘤坏死因子或酶；任选地，所述蛋白质为人血清白蛋白。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述连接位点为人血清白蛋白上的34位半胱氨酸。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述引发剂为式(i)所示化合物10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将预先溶于缓冲溶液中的所述蛋白质与所述引发剂在室温条件下进行连接处理5分钟-24小时。11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白质与所述引发剂的偶联比是1:1。12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白质-引发剂结合体、所述单体化
合物、所述cucl、所述1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺的摩尔比为1:500:40:100。13.一种蛋白质-高分子两亲体，其特征在于，所述蛋白质-高分子两亲体是根据权利要求1～12任一项所述的方法获得的。14.一种蛋白质-高分子两亲体，其特征在于，包括：亲水区，所述亲水区包含蛋白质；以及疏水区，所述疏水区包含高分子，所述高分子是由所述单体化合物2-(二异丙基氨基)甲基丙烯酸乙酯聚合而成的，所述高分子在ph5～10范围内具有ph响应性，所述高分子pka为5-10。15.一种纳米颗粒，其特征在于，由权利要求13或14任一项所述的蛋白质-高分子两亲体自组装形成，包括：疏水核心，所述疏水核心由所述蛋白质-高分子两亲体的疏水区构成；以及亲水外壳，所述亲水外壳设置所述疏水核心的外表面，由所述蛋白质-高分子两亲体的亲水区构成。16.根据权利要求15所述的纳米颗粒，其特征在于，进一步包括装载化合物。17.根据权利要求16所述的纳米颗粒，其特征在于，所述化合物包括疏水性小分子药物和荧光分子。18.根据权利要求17所述的纳米颗粒，其特征在于，所述小分子药物包括选自吉西他滨、紫杉醇、阿霉素、吉非替尼、甲氨蝶呤中的至少之一。19.根据权利要求17所述的纳米颗粒，其特征在于，所述荧光分子包括选自磺酰罗丹明b、吲哚菁绿、异硫氰酸荧光素、溴化乙锭、水溶性荧光蓝、茶酐类水溶性荧光染料、水溶性菁染料琥珀酰亚胺酯类染料、藻红蛋白香豆素、细胞膜红色荧光探针、罗丹明200以及荧光素酯中的至少之一。20.根据权利要求16所述的纳米颗粒，其特征在于，所述化合物为吲哚菁绿。21.一种制备纳米探针的方法，其特征在于，将权利要求13或14任一项所述的蛋白质-高分子两亲体与待包载荧光分子进行接触，以便获得所述纳米探针。22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述待包载荧光分子包括选自磺酰罗丹明b、吲哚菁绿、异硫氰酸荧光素、溴化乙锭、水溶性荧光蓝、茶酐类水溶性荧光染料、水溶性菁染料琥珀酰亚胺酯类染料、藻红蛋白香豆素、细胞膜红色荧光探针、罗丹明200以及荧光素酯中的至少之一。23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述接触是在室温、暗处理条件下进行5分钟～24小时。24.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述蛋白质-高分子两亲体和所述待包载荧光分子的摩尔比为1:(0.5-20)。25.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求13或14所述的蛋白质-高分子两亲体或包括权利要求15～20任一项所述的纳米颗粒，所述蛋白质-高分子两亲体和/或所述纳米颗粒包载的分子和/或蛋白质为药物分子。26.一种荧光成像方法，其特征在于，将权利要求13或14所述的蛋白质-高分子两亲体或包括权利要求15～20任一项所述的纳米颗粒递送到待成像微环境中，所述蛋白质-高分子两亲体和/或纳米颗粒包载的分子为荧光分子。

技术总结
本发明提出了一种制备蛋白质-高分子两亲体的方法，该方法包括：(1)将引发剂与蛋白质进行共价连接，以便获得蛋白质-引发剂结合体；(2)将所述蛋白质-引发剂结合体与单体化合物进行原位聚合，以便获得蛋白质-高分子两亲体，所述高分子在pH5～10范围内具有pH响应性，所述高分子pKa在5-10；该方法操作简单，化学结构明确，收率高，同时根据该方法制备得到的蛋白质-高分子两亲体的蛋白活性高、pH响应性灵敏度高，可以作为化疗药物或诊断试剂的递送载体，提高小分子药物的靶向性，降低其副作用；同时蛋白质本身可以选择一些药用蛋白，借助pH响应性的高分子的靶向作用，可提高药用蛋白稳定性及其靶向性，有望极大拓展蛋白质药物在肿瘤诊疗中的应用。诊疗中的应用。


技术研发人员：高卫平 李朋勇
受保护的技术使用者：清华大学
技术研发日：2018.03.23
技术公布日：2022/11/1