本发明属于基因工程，具体涉及一种通过敲除林可链霉菌ecta基因提高林可霉素产量的方法。
背景技术：
1、林可霉素(lincomycin)由林可链霉菌(streptomyces lincolnensis)生产而来，是一种林可酰胺类抗生素(lincosamides)，广泛用于治疗革兰氏阳性菌引起的感染性疾病。它可以作为兽用抗生素用于治疗家禽家畜的痢疾、坏死性肠炎，也能作为临床用药，特别是在厌氧菌和需氧菌混合微生物群预计会产生协同效应的情况下，如骨和关节感染、预防术后腹腔内感染、口腔感染、厌氧败血症、皮肤和粘膜感染等，也用于治疗牙周炎。在治疗对青霉素过敏的患者的上呼吸道感染时，林可霉素也是青霉素及其衍生物的有效替代品。我国是林可霉素原料药的主要生产国和出口国，随着我国养殖、畜牧业的发展，林可霉素抗生素需求量日益增长，提高林可霉素产量尤为重要。
2、现阶段，林可霉素工业生产菌株主要通过物理或化学诱变方法获得，而传统的诱变技术不但耗时耗力，且随机性较大，无法满足提高林可霉素产量的需求。
技术实现思路
1、针对以上问题，本发明提供一种通过敲除林可链霉菌ecta基因提高林可霉素产量的方法。本发明通过敲除林可链霉菌中四氢嘧啶合成途径中2，4-二氨基丁酸乙酰基转移酶编码基因ecta基因，显著提高了林可霉素的发酵产量。
2、为达到上述发明目的，本发明采用了如下技术方案：
3、本发明第一方面提供了一种通过敲除林可链霉菌ecta基因提高林可霉素产量的方法：将林可链霉菌的ecta基因敲除，用所得突变株发酵生产林可霉素，所述ecta基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
4、ecta基因的核苷酸序列(seq id no.1)：
5、atgactgccgcacaagcagacctgcacatcgaccgcccgacggtggccgacggcgccgcactgtggcggatggcaaaggactcgaaggtcctggacctgaactcgtcctacagctatctgctgtggtgccgcgacttcgccgccacgtccgccgtggcgcgcgacgagcacggcgagccggtcggcttcgtcaccggatacctccggccggaccacccggccaccctgctcgtctggcaggtcgcggtggacgaggcacaccgcggccgcggactcgccgccgccctgctggacgggctggtcgcacggaccgccctggagcacggaaccagcaccgtcgagaccacgatcacgccgggcaacatcgcctccgaacgcctgttcacgtcgttcgccgagcgtcacggcgcccggctggagcgcgaggtgctgttcgacacggccctgttccccgacgggccgcacgaccccgaggtcctgtaccgcatcggccccctgtccctgactccctctgcctga。
6、林可霉素和四氢嘧啶(ectoine)的生物合成都以l-天冬氨酸(l-asp)为前体，二着存在竞争底物的关系。ecta是林可链霉菌四氢嘧啶合成途径中2，4-二氨基丁酸乙酰基转移酶的编码基因。本发明通过敲除ecta基因而对四氢嘧啶途径进行阻断，使更多的营养物质与能量富集到林可霉素的合成过程中，从而显著提高林可霉素的发酵产量。
7、本发明第二方面提供了一种ecta基因缺失型林可链霉菌突变株的构建方法：通过基因工程途径使林可链霉菌中的ecta基因被与四氢嘧啶合成无关的基因取代；其中所述ecta基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
8、优选地，所述构建方法以林可链霉菌nbrc13054为出发菌株。
9、优选地，所述与四氢嘧啶合成无关的基因为氨苄抗性基因。
10、进一步优选地，所述构建方法具体包括以下步骤：
11、s1、以林可链霉菌nbrc13054的基因组dna为模板，分别以ecta-u-f和ecta-u-r以及ecta-d-f和ecta-d-r为引物，通过pcr反应分别扩增ecta基因的上、下游同源臂，所述ecta-u-f、ecta-u-r、ecta-d-f和ecta-d-r的核苷酸序列分别如seq id no.2、seq idno.3、seq id no.4和seq id no.5所示；以puc57-amp质粒为模板，以amp-f和amp-r为引物，通过pcr反应扩增氨苄抗性基因；所述amp-f和amp-r的核苷酸序列分别如seq id no.6和seq id no.7所示；
12、s2、将pkc1139质粒进行双酶切，将所得酶切产物与s1得到的上、下游同源臂和氨苄抗性基因连接，得到pkc1139-δecta敲除载体；
13、s3、将所述pkc1139-δecta敲除载体转化到大肠杆菌感受态细胞中，经培养后作为供体菌株；
14、s4、将所述供体菌株与林可链霉菌菌丝体在无抗培养基中共同培养，形成雾状菌后，以抗生素覆盖，培养至长出结合子，经筛选得到ecta基因缺失型林可链霉菌突变株。
15、上述步骤通过基因工程技术定向改造林可链霉菌的编码基因，使ecta基因被与四氢嘧啶合成无关的氨苄抗性基因取代，从而能够获得林可霉素高产工程菌株，即，ecta基因缺失型林可链霉菌突变株。该突变株可用于高效生产林可霉素或其合成过程中的产物。
16、在该构建方法中，用于扩增获得ecta基因的上、下游同源臂的引物在pcr扩增时容易出现条带不特异的情况，目的条带周围有杂带。上述ecta-u-f、ecta-u-r、ecta-d-f和ecta-d-r是经过多次设计得到，具有良好的特异性。
17、优选地，s1中所述pcr的反应体系为：
18、
19、pcr反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s，70℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃终延伸5min。
20、优选地，s2中对pkc1139质粒进行双酶切的内切酶为xbai和ecori。
21、进一步优选地，所述双酶切的反应体系为：
22、
23、所述双酶切的反应条件为：37℃酶切3h，65℃失活。
24、优选地，s2中利用clon iione step cloning kit c113连接酶通过酶连反应将所述酶切产物与所述上、下游同源臂和氨苄抗性基因连接。
25、进一步优选地，酶连反应体系为：
26、
27、酶连反应条件为：在37℃连接30min。
28、该上述酶连反应体系中，各组分的用量和比例对于对于能否成功连接至关重要，添加比例不合适会造成连接失败。
29、优选地，s3中所述大肠杆菌感受态细胞为et12567大肠杆菌感受态细胞；s4中所述林可链霉菌为林可链霉菌nbrc13054。
30、优选地，s4的具体操作方法为：将所述供体菌株的菌悬液与林可链霉菌菌丝体悬液混合，离心，弃掉上清，将菌液在无抗的wl-50平板上培养至表面形成雾状菌，以安普霉素和萘啶酮酸钠覆盖后，培养至长出结合子，经筛选得到ecta基因缺失型林可链霉菌突变株。
31、进一步优选地，所述抗生素为安普霉素和萘啶酮酸钠，二者以溶液形式进行覆盖，覆盖后晾干，再进行倒置培养。更进一步优选地，安普霉素与萘啶酮酸钠的溶液体积为菌液体积的10倍，安普霉素溶液的浓度为1mg/ml，萘啶酮酸钠溶液的浓度为0.5mg/ml。二者的用量和浓度能确保其具备抗性，能用于覆盖。
32、本发明第三方面提供了用上述构建方法构建的ecta基因缺失型林可链霉菌突变株。
33、本发明第四方面提供了上述ecta基因缺失型林可链霉菌突变株在发酵生产林可霉素中的应用。
34、优选地，先将所述ecta基因缺失型林可链霉菌突变株消除pkc1139-δecta敲除载体，然后在一级发酵培养基中培养2～4d，发酵温度为28℃，再接种至二级发酵培养基中发酵培养6～8d，发酵温度为28℃；所述一级发酵培养基的成分为：葡萄糖10g/l，可溶性淀粉20g/l，黄豆饼粉10g/l，玉米浆3g，caco34g/l，(nh4)2so4 1.5g/l，ph＝7.0-7.2；所述二级发酵培养基的成分为：葡萄糖100g/l，黄豆饼粉20g/l，(nh4)2so4 1.5g/l，玉米浆1.5g/l，nano3 8g/l，k2hpo3 0.3g/l，caco3 8g/l，ph＝7.0-7.2。
35、本发明的有益效果在于：本发明从竞争底物的关系的角度，对林可霉素四氢嘧啶合成途径中的ecta基因进行敲除，减少四氢嘧啶的生物合成，将前体物质尽可能富集到林可霉素合成途径中，从而显著提高以林可链霉菌发酵生产林可霉素的产量。结果表明，ecta基因缺失后，林可霉素产量极显著增加。本发明提供的ecta基因缺失型林可链霉菌突变株的构建方法通过基因工程技术定向改造林可链霉菌的编码基因，进而获得林可霉素高产工程菌株，所得工程菌株能够用于高效生产林可霉素或其合成过程中的产物。经实验验证，该构建方法得到的ecta基因缺失型林可链霉菌突变株发酵液中林可霉素平均产量能够达到201.47mg/l，最高产量能够达到239.67mg/l，相对于野生型nbrc13054菌株发酵液中林可霉素的平均产量115.50mg/l，以ecta基因缺失型林可链霉菌突变株发酵生产林可霉素的产量较野生型菌株提高了107.5％。本发明为提高林可霉素产量提供了一种稳定、可行的新方法，并能够对林可霉素高产的精准高效生产提供理论指导。
1.一种通过敲除林可链霉菌ecta基因提高林可霉素产量的方法，其特征在于，将林可链霉菌的ecta基因敲除，用所得突变株发酵生产林可霉素，所述ecta基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
2.一种ecta基因缺失型林可链霉菌突变株的构建方法，其特征在于，所述通过基因工程途径使林可链霉菌中的ecta基因被与四氢嘧啶合成无关的基因取代；其中所述ecta基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法以林可链霉菌nbrc13054为出发菌株。
4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述与四氢嘧啶合成无关的基因为氨苄抗性基因。
5.根据权利要求2～4任一项所述的构建方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，s2中对pkc1139质粒进行双酶切的内切酶为xbai和ecori。
7.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，s2中利用cloniione stepcloning kit c113连接酶通过酶连反应将所述酶切产物与所述上、下游同源臂和氨苄抗性基因连接。
8.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，s3中所述大肠杆菌感受态细胞为et12567大肠杆菌感受态细胞；s4中所述林可链霉菌为林可链霉菌nbrc13054。
9.用权利要求2～8任一项所述构建方法构建的ecta基因缺失型林可链霉菌突变株。
10.权利要求9所述的ecta基因缺失型林可链霉菌突变株在发酵生产林可霉素中的应用。
