本发明属于肝脏获取，具体涉及一种获取小鼠肝细胞的方法。
背景技术：
1、肝脏是维持生命最重要的器官之一，是人体内最大的内脏器官。肝细胞是肝脏中最重要的实质细胞，约占肝脏体积的80％，执行肝脏的主要生物学功能，包括物质代谢、解毒、合成蛋白质、调控能量代谢等，任何原因引起的肝细胞损伤均会不同程度地影响肝脏的这些功能。因此，通过有效分离肝细胞来研究肝脏功能十分必要。
2、常规肝细胞分离的方法是在小鼠处于麻醉状态时对小鼠肝脏进行在体灌注，从而获得肝细胞。然而，在体灌注所需实验条件较为复杂，操作繁琐，小鼠肝细胞的分离通常受到实验条件的限制。
技术实现思路
1、为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种获取小鼠肝细胞的方法，用以解决现有的小鼠肝细胞分离方法复杂的技术问题。
2、为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
3、本发明的第一个方面，公开了一种获取小鼠肝细胞的方法，包括以下步骤：
4、1)对离体的小鼠肝脏进行灌流，直至小鼠肝脏变白，得到变白的小鼠肝脏；
5、2)对变白的小鼠肝脏进行消化，得到消化后的小鼠肝脏组织；
6、3)对消化后的小鼠肝脏组织进行分离，离心取沉淀，得到小鼠肝细胞。
7、优选地，步骤1)中，灌流前，夹住小鼠的肝动静脉丛。
8、优选地，步骤1)中，灌流液为i型胶原酶消化液。
9、进一步优选地，i型胶原酶消化液的配方为：在500ml hbss缓冲液中添加1190mg的hepes和280mg的cacl2混匀，得到组织消化缓冲液；每10ml组织消化缓冲液中加入5mg胶原酶i，得到i型胶原酶消化液。
10、优选地，步骤1)中，在离体的小鼠每叶肝的中间部位灌注灌流液。
11、进一步优选地，步骤1)中，采用注射器进行灌流。
12、进一步优选地，步骤1)中，注射器的刺入深度为该叶肝厚度的1/2。
13、优选地，步骤2)中，消化之前，去除变白的小鼠肝脏的多余组织，充分剪碎剩余肝脏组织至肉眼看不到明显组织块。
14、进一步优选地，步骤2)中，在i型胶原酶消化液和dna酶i溶液的混合液中去除变白的小鼠肝脏的多余组织，充分剪碎剩余肝脏组织至肉眼看不到明显组织块。
15、优选地，步骤2)中，采用i型胶原酶消化液和dna酶i溶液的混合液对变白的小鼠肝脏进行消化。
16、进一步优选地，步骤2)中，混合液中，i型胶原酶消化液与dna酶i溶液的体积比为100:1。
17、进一步优选地，i型胶原酶消化液的配方为：在500ml hbss缓冲液中添加1190mg的hepes和280mg的cacl2混匀，得到组织消化缓冲液；每10ml组织消化缓冲液中加入5mg胶原酶i，得到i型胶原酶消化液；dna酶i溶液的配方为：将20mg dna酶i中加入10ml gbss中充分溶解，得到dna酶i溶液。
18、优选地，步骤3)中，分离步骤为：离心去上清，重复加入dmem和dna酶i溶液离心、洗涤的步骤，弃尽上清，留沉淀，得到小鼠肝细胞。
19、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
20、本发明提供的一种获取小鼠肝细胞的方法，1)采用肝脏离体灌流法分离小鼠原代肝细胞，操作简单易行，对实验室条件要求较低，不需要额外连接灌注管及蠕动泵进行灌流。2)在分离之前，对变白的小鼠肝脏进行充分消化，能够克服离体灌流不能保证肝脏组织充分消化的问题，提高分离得到的肝细胞的纯度和活率。通过实验证明，本方法与在体灌注肝脏分离所得肝细胞的细胞活率及形态相差不大，小鼠肝细胞生长状态良好，贴壁的细胞，大部分为小鼠肝细胞，表明本方法可以成功分离小鼠的肝细胞，有望连续或同时对多只小鼠进行此操作，成为实验室简单易操作的获取小鼠肝细胞的方法，这使得在实验所需动物较多时，便于对小鼠肝细胞进行分离，进行后续的测序分析及培养等试验。
21、进一步地，灌流时夹住小鼠的肝动静脉丛，形成接近密闭的灌流环境，保证充分灌流。
22、进一步地，不需要额外灌注egta溶液，仅灌注一次i型胶原酶消化液，就能保证小鼠肝脏的充分灌流。
23、进一步地，在离体的小鼠每叶肝的中间部位进行灌注，能够保证冲洗掉红细胞的同时，使肝实质细胞变得松散，致使小鼠肝细胞易于从组织中分离出来；操作简单、高效。
24、进一步地，同时使用i型胶原酶消化液和dna酶i溶液进行离体消化，使细胞离散的同时，防止dna导致的细胞凝集；同时保证在随后的低速离心过程中，细胞密度较大的肝细胞较其它细胞更容易沉淀下来。
1.一种获取小鼠肝细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种获取小鼠肝细胞的方法，其特征在于，步骤1)中，灌流前，夹住小鼠的肝动静脉丛。
3.根据权利要求1所述的一种获取小鼠肝细胞的方法，其特征在于，步骤1)中，灌流液为i型胶原酶消化液。
4.根据权利要求1所述的一种获取小鼠肝细胞的方法，其特征在于，步骤1)中，在离体的小鼠每叶肝的中间部位灌注灌流液。
5.根据权利要求3所述的一种获取小鼠肝细胞的方法，其特征在于，步骤1)中，采用注射器进行灌流，注射器的刺入深度为该叶肝厚度的1/2。
6.根据权利要求1～5任意一项所述的一种获取小鼠肝细胞的方法，其特征在于，步骤2)中，消化之前，去除变白的小鼠肝脏的多余组织，充分剪碎剩余肝脏组织至肉眼看不到明显组织块。
7.根据权利要求6所述的一种获取小鼠肝细胞的方法，其特征在于，步骤2)中，在i型胶原酶消化液和dna酶i溶液的混合液中去除变白的小鼠肝脏的多余组织，充分剪碎剩余肝脏组织至肉眼看不到明显组织块。
8.根据权利要求1～5任意一项所述的一种获取小鼠肝细胞的方法，其特征在于，步骤2)中，采用i型胶原酶消化液和dna酶i溶液的混合液对变白的小鼠肝脏进行消化。
9.根据权利要求8所述的一种获取小鼠肝细胞的方法，其特征在于，步骤2)中，混合液中，i型胶原酶消化液与dna酶i溶液的体积比为100:1。
10.根据权利要求1～5任意一项所述的一种获取小鼠肝细胞的方法，其特征在于，步骤3)中，分离步骤为：离心去上清，重复加入dmem和dna酶i溶液离心、洗涤的步骤，弃尽上清，留沉淀，得到小鼠肝细胞。
