本发明涉及生物医药，具体涉及一种结直肠癌类器官培养试剂盒。
背景技术：
1、类器官(organoids)是以干细胞或器官祖细胞为原料，经过体外培养，能发生细胞分化及谱系定向，即自组装为器官样结构的细胞群，可以很大程度上模拟目标组织或器官的遗传特征和表观特征，充分保留了人体的免疫学与组织学特征。形成的细胞簇，它可模拟体内肿瘤特征及肿瘤细胞异质性，该技术的建立未为癌症研究和治疗提供了可靠的模型，特别是为个性化癌症治疗开辟了新的视野。与传统肿瘤研究模型相比，肿瘤类器官可以最大程度地模拟肿瘤在体内的结构和功能，既能直观展现肿瘤生长的过程，又能反映患者个体差异，是一种直观、可靠、高效和避免伦理争议的器官水平研究体系，更加适合于体外的肿瘤生物学和治疗相关的研究。
2、类器官在商业市场的应用主要在新药研发以及拓展适应症等方向。目前大约85％的临床前药物在进入临床试验后开发失败，造成巨大的花费和损失，而类器官可在临床前进行更充分的效价评估，对于后期药物开发成本的降低有巨大的价值；在抗肿瘤药物研发中，pdo能够高通量低成本地反应肿瘤异质性，有效弥补pdx动物模型的不足；类器官作为“患者替身”的phase 0“准临床试验”，可提高临床试验成功率。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种结直肠癌类器官培养试剂盒，用于人体结直肠癌的处理和体外培养，培养的细胞仅用于临床体外诊断用途，不用于细胞治疗、细胞回输、辅助生殖等冶疗用途。
2、为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
3、一种结直肠癌类器官培养试剂盒，包括类器官培养基a、添加物组分b，
4、所述类器官培养基a包括以下组分：改良型dmem/f12培养基、100×青霉素链霉素、1mhepes、200mm l-丙氨酰-l-谷氨酰胺、100×n2添加剂、50×b27添加剂；
5、所述添加物组分b包括以下组分:生理盐水、20％磺丁基醚β-环糊精衍生物、10um胃泌素1、1mm a83-01、5mm sb202190、10.11mm y-27632、600μg/ml重组人wnt-3a、200mm n-乙酰-l-半胱氨酸、50ug/ml重组人表皮生长因子、100ug/ml重组人r-spondin蛋白、50ug/ml重组人noggin蛋白。
6、本发明优选的，还包括基质胶，所述基质胶为动物鼠尾酶解物。
7、本发明优选的，还包括消化液、样本保存液；
8、所述消化液用hank's平衡盐溶液配制，包括以下组分：3g/l iv型胶原酶、1g/l透明质酸酶、0.2g/l硫酸庆大霉素、10.11mm y-27632；
9、所述样本保存液用dmem配制，包括以下组分：0.5g/l氨苄青霉素、0.5g/l链霉素、0.1g/l硫酸庆大霉素、2mg/l两性霉素b、10.11mm y-27632、10ml/l胎牛血清。
10、本发明优选的，类器官培养基a的ph值为7.0～7.2。
11、本发明优选的，培养结直肠癌类器官的方法包括以下步骤：
12、(1)将样本放入含有样本保存液的组织取样瓶中，快速转运至洁净实验室进行组织处理和细胞分离，拍照并登记信息；
13、(2)准备若干培养皿，加入4度预冷的类器官培养基a备用；
14、(3)取样瓶消毒，将样本放入培养皿中，用类器官培养基a冲洗三次，用消毒的眼科剪或手术刀将样本剪切成体积约为1～3mm3的组织块；
15、(4)加入消化液于37℃震荡消化后，加入dmem培养基终止消化；
16、(5)使用筛网进行过滤后，离心并移去上清，添加dmem培养基重新离心；
17、(6)添加基质胶重悬并在冰上操作铺板；
18、(7)将铺好的培养板放入37℃培养箱中10-15min成胶，添加完整类器官培养基进行培养。
19、本发明优选的，基质胶使用前用类器官培养基a进行稀释，稀释浓度为类器官培养基a：基质胶＝1:4。
20、本发明优选的，类器官培养基a中加入添加物组分b后构成完整类器官培养基后使用，a:b体积比＝200:1。
21、本发明优选的，药物筛选的方法包括以下步骤：
22、(1)将96孔板中培养基小心吸出；
23、(2)向96孔板中每个孔加入150μl的消化液，充分混匀胶；
24、(3)将消化液吸出，放入15ml离心管中；
25、(4)将15ml离心管放入37℃摇床中20min，转速为100rpm；
26、(5)用含2％胎牛血清的dmem/f12培养基稀释基质胶消化液；
27、(6)300g离心3min，得到下层细胞沉淀；
28、(7)若沉淀中有胶体存在，将上层溶液吸出，重复2-5步；
29、(8)化胶完成后，将类器官300g离心3min，取出上清，用pbs清洗类器官，加入类器官培养基重悬细胞，将类器官计数为6000个细胞/ml；
30、(9)将类器官接种于96孔板中，再将药物按对应浓度0μm 5μm 10μm 25μm 50μm添加于每组细胞中，总体积为120μl；
31、(10)二氧化碳培养箱培养48h后，每个孔中加入100μl的celltiter-lumitmplusii；
32、(11)将96孔板放置于37℃摇床上2min裂解细胞；
33、(12)裂解完成后，将孔板置于室温10min；
34、(13)用酶标仪检测，记录发光值，计算ic50。
35、本发明优选的，所述药物为5氟尿嘧啶、奥沙利铂、多西他赛、雷替曲塞、瑞戈非尼、贝伐珠单抗或特瑞普利单抗。
36、本发明的有益效果在于：
37、针对疑难罕见肿瘤没有标准用药方案、原发或继发性耐药、未发现靶点突变导致靶向药不适、肿瘤异质性导致相同药物疗效不同等问题，本发明试剂盒可以定向培养结直肠癌类器官，并且可以利用培养成功的类器官进行结直肠癌药物筛选，从而抓住肿瘤治疗的关键窗口期、选择最合适的个性化用药方案，最终达到延长患者生存期、减少试药次数、节省总治疗费的目的，并且无需额外采样。通过本发明的实施，还可有效维持结直肠癌类器官中的肿瘤免疫组份。
1.一种结直肠癌类器官培养试剂盒，其特征在于，包括类器官培养基a、添加物组分b，
2.根据权利要求1所述的一种结直肠癌类器官培养试剂盒，其特征在于，还包括基质胶，所述基质胶为动物鼠尾酶解物。
3.根据权利要求1所述的一种结直肠癌类器官培养试剂盒，其特征在于，还包括消化液、样本保存液；
4.根据权利要求1所述的一种结直肠癌类器官培养试剂盒，其特征在于，类器官培养基a的ph值为7.0～7.2。
5.利用权利要求1至4任意一项所述的结直肠癌类器官培养试剂盒培养结直肠癌类器官的方法，其特征在于，
6.根据权利要求5所述的培养结直肠癌类器官的方法，其特征在于，基质胶使用前用类器官培养基a进行稀释，稀释浓度为类器官培养基a:基质胶＝1:4。
7.根据权利要求5所述的培养结直肠癌类器官的方法，其特征在于，类器官培养基a中加入添加物组分b后构成完整类器官培养基后使用，a:b体积比＝200:1。
8.一种药物筛选的方法，其特征在于，所述肠癌类器官采用权利要求5至7任意一项所述的方法获得，所述药物筛选的方法包括以下步骤：
9.根据权利要求8所述的药物筛选的方法，其特征在于，所述药物为5氟尿嘧啶、奥沙利铂、多西他赛、雷替曲塞、瑞戈非尼、贝伐珠单抗或特瑞普利单抗。
