本发明涉及医用纳米材料领域，特别是涉及一种crispr/cas14a偶联tdt的电化学生物传感器及其制备方法和应用。
背景技术：
1、鼻咽癌(npc)是一种起源于鼻咽粘膜上皮层的恶性肿瘤，在中国的南方和东南亚国家发病率最高，这种疾病会引起多种症状，包括喉咙痛、呼吸困难、说话和听力困难等。由于其临床症状和体征隐匿，加之鼻咽部位置相对隐蔽，使得早期病变的识别更加复杂，很容易导致对该病的误诊、漏诊，从而延误治疗，大约70-80％的患者在npc确诊时，已是晚期。所以鼻咽癌的早期诊断非常必要。
2、目前临床上常用的鼻咽癌的诊断方式有鼻内镜检查，鼻咽部影像学检查，但是这些检查方法都存在漏诊率较高的缺点，病人需要多次诊断方能确诊，对病人的治疗预后极为不利。近年来，用于早期诊断生物标志物的发现为鼻咽癌的早期诊断带来新的方向。目前研究发现与鼻咽癌相关的生物标志物主要是以血清标志物为主，如血清中的组织蛋白酶b和组织蛋白酶d、eb病毒抗体sa、胰岛素样生长因子i(igf-1)等，这些生物标志物在鼻咽癌的诊断和筛查中都表现出一定的价值，但这些生物标志物特异性普遍较低。研究发现，外泌体在npc早期诊断中具有巨大的潜力。
3、外泌体是由细胞在正常或病理状态下分泌到细胞外的一种小型囊泡，直径多在40-160nm，其内含丰富的蛋白质、脂质和信息物质，参与细胞间多种信号转导与诸多病理、生理过程。外泌体作为一种新型的生物标志物，在鼻咽癌的早期诊断中已多有研究。研究发现，epcam在鼻咽癌患者血浆外泌体中表达升高，可以作为鼻咽癌早期诊断的生物标志物。
4、外泌体的检测，目前已公开报道的方法包括动态光散射(dls)、多角度光散射(mals)和纳米粒子跟踪分析(nta)等，可对外泌体的粒径和浓度进行测量。这些表征方法虽得到一定程度的应用，但是对外泌体的检测无特异性，无法实现对特定来源外泌体的定量分析，而且需要昂贵的设备。近些年，各种类型的生物传感器如荧光传感器、电化学传感器、比色传感器、表面增强拉曼传感器(sers)等被开发出来，用于实现对外泌体的定量检测，尤其在对特定来源外泌体的检测中表现突出。电化学生物传感器可以将对外泌体的检测转化为对电化学信号的检测，相对而言，对设备要求低且选择性好、操作简便而且灵敏度高，在临床应用上具有更大的操作可能性。
5、近年来，crispr/cas系统因其强大的基因编辑能力，在基因编辑领域备受关注。由于crispr/cas系统的向导rna与靶标核酸特异性结合能触发其非特异的附属切割活性，越来越被广泛的应用于生物传感器的设计之中。crispr/cas14a作为crispr/cas家族的一员，其在sgrna的引导下，特异结合靶标ssdna，且无需pam位点，并激活其反式切割ssdna的活性，实现对体系内ssdna的无选择性切割。虽然crispr/cas14a能够保证检测的特异性，但缺乏足够的灵敏度，因此结合信号放大策略探究一种能够提高crispr/cas系统在生物传感器中的检测灵敏度，对于外泌体的检测具有重要意义。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种crispr/cas14a偶联tdt的电化学生物传感器及其制备方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，通过tdt偶联cas14a来放大电化学信号，用于鼻咽癌来源外泌体的检测，操作更简便，并且能够实现对鼻咽癌来源外泌体的选择性定量检测，且具有高灵敏度和特异性。
2、实现了对鼻咽癌来源外泌体的高特异性、高灵敏性检测。
3、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
4、本发明提供一种crispr/cas14a偶联tdt的电化学生物传感器，所述电化学生物传感器包括金电极以及crispr-cas14系统，所述crispr-cas14系统是通过链霉亲合素修饰的磁纳米颗粒、生物素修饰的适配体、与所述适配体碱基互补的探针、末端脱氧核苷酸转移酶、脱氧胸苷三磷酸、sgrna和cas14a构建而成。
5、优选的是，所述金电极为采用ssdna处理过的金电极，所述ssdna为采用甲基蓝和巯基双标记的单链dna。
6、优选的是，所述ssdna的核苷酸序列如seq id no：3所示。
7、优选的是，所述适配体的核苷酸序列如seq id no：1所示，所述探针的核苷酸序列如seq id no：2所示，所述sgrna的核苷酸序列如seq id no：4所示。
8、本发明还提供一种所述的电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
9、金电极经预处理进行修饰，得到修饰后的金电极；
10、洗涤链霉亲合素修饰的磁纳米颗粒后，重悬于缓冲液，然后与生物素修饰的适配体以及与所述适配体碱基互补的探针混合孵育，洗涤，得到复合物；
11、将末端脱氧核苷酸转移酶和脱氧胸苷三磷酸与所述复合物混合进行延伸反应，得到poly-t溶液；
12、将sgrna、cas14a与所述poly-t溶液混合进行切割反应，得到crispr-cas14系统；
13、所述修饰后的金电极与所述的crispr-cas系统组合即为所述电化学生物传感器。
14、优选的是，所述金电极经预处理进行修饰包括采用甲基蓝和巯基乙醇对所述金电极进行修饰的步骤，得到甲基蓝和巯基双标记的金电极，即为所述修饰后的金电极。
15、优选的是，所述洗涤用的洗涤剂为pbs溶液；所述缓冲液包括以下浓度组分：10mmpbs，100mm nacl和20mm mgcl2；
16、所述链霉亲合素修饰的磁纳米颗粒的浓度为10-40pg/ml，所述适配体的浓度为10-40nm，与所述适配体碱基互补的探针的浓度为10-40nm，所述混合孵育的温度为37℃，时间为30分钟。
17、优选的是，所述末端脱氧核苷酸转移酶的浓度为1-6u，所述脱氧胸苷三磷酸的浓度为10-100μm，所述延伸反应的时间是20-80分钟；
18、所述sgrna、cas14a的浓度均为20-80nm，所述切割反应的时间为10-60分钟。
19、本发明还提供利用所述的电化学生物传感器检测外泌体的方法，向所述crispr-cas14系统中加入待测外泌体，然后将所述金电极浸入所述crispr-cas14系统中检测电化学信号强度，根据所述待测外泌体检测前和检测后的电流信号变化，实现外泌体的检测。
20、本发明还提供所述的电化学生物传感器在如下任一项中的应用：
21、(1)制备检测鼻咽癌来源的外泌体的产品中的应用；
22、(2)制备用于早期诊断鼻咽癌的产品中的应用。
23、本发明公开了以下技术效果：
24、本发明使用的tdt可催化在靶dna的3'羟基(3'-oh基团)末端加成脱氧核糖核苷三磷酸(dntps)，形成多核苷酸尾部(如poly t)。将超长的poly t与cas14a/sgrna体系结合，同时结合多个靶标，形成“一靶多信号”的放大效应。本发明基于电化学检测策略，通过tdt偶联cas14a来放大电化学信号，用于鼻咽癌来源的外泌体检测中，解决了常规方法检测外泌体操作复杂、设备昂贵、选择性差等问题，本发明提供的电化学生物传感器实现鼻咽癌来源外泌体的高灵敏性、高特异性检测，为鼻咽癌的早期诊断奠定理论基础。
1.一种crispr/cas14a偶联tdt的电化学生物传感器，其特征在于，所述电化学生物传感器包括金电极以及crispr-cas14系统，所述crispr-cas14系统是通过链霉亲合素修饰的磁纳米颗粒、生物素修饰的适配体、与所述适配体碱基互补的探针、末端脱氧核苷酸转移酶、脱氧胸苷三磷酸、sgrna|和cas14a构建而成。
2.如权利要求1所述的电化学生物传感器，其特征在于，所述金电极为采用ssdna处理过的金电极，所述ssdna为采用甲基蓝和巯基双标记的单链dna。
3.如权利要求2所述的电化学生物传感器，其特征在于，所述ssdna的核苷酸序列如seqid no：3所示。
4.如权利要求1所述的电化学生物传感器，其特征在于，所述适配体的核苷酸序列如seq id no：1所示，所述探针的核苷酸序列如seq id no：2所示，所述sgrna的核苷酸序列如seq id no：4所示。
5.一种权利要求1-4任一项所述的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述金电极经预处理进行修饰包括采用甲基蓝和巯基乙醇对所述金电极进行修饰的步骤，得到甲基蓝和巯基双标记的金电极，即为所述修饰后的金电极。
7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述洗涤用的洗涤剂为pbs溶液；所述缓冲液包括以下浓度组分：10mm pbs，100mm nacl和20mm mgcl2；
8.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述末端脱氧核苷酸转移酶的浓度为1-6u，所述脱氧胸苷三磷酸的浓度为10-100μm，所述延伸反应的时间是20-80分钟；
9.利用权利要求1-4任一项所述的电化学生物传感器检测外泌体的方法，其特征在于，向所述crispr-cas14系统中加入待测外泌体，然后将所述金电极浸入所述crispr-cas14系统中检测电化学信号强度，根据所述待测外泌体检测前和检测后的电流信号变化，实现外泌体的检测。
10.如权利要求1-4任一项所述的电化学生物传感器在如下任一项中的应用：
