本发明属于农业，尤其涉及一种尖孢镰孢菌辣椒专化型精准检测引物及其应用。
背景技术：
1、辣椒枯萎病是由尖孢镰孢菌辣椒专化型(fusarium oxysporumf.sp.capsicum)引起的辣椒系统性土传病害，在各辣椒产区普遍发生，对辣椒的产量、品质造成严重损失。
2、由于辣椒枯萎病是在辣椒结果期发病，一旦发病，因其为系统性病害，造成整株萎蔫，死亡，轻者减产30-50％，严重者造成绝产绝收，严重影响效益。
3、另外，辣椒连作，造成土壤中尖孢镰孢菌富集积累，造成严重的连作障碍；在设施辣椒田危害尤其严重，目前，生产中农民通过大量使用化学农药进行土壤消毒，人力物力投入巨大，且造成严重的土壤农药污染。
4、再者，由于土传病害受外界环境因素较小，土壤中病原菌通常是流行病害的决定性因素，所以，构建尖孢镰孢菌辣椒专化型精准检测体系，定量检测辣椒田病原菌数量对辣椒枯萎病的预测预报、有效防治，合理安排作物种类克服重茬障碍，具有重要意义。
5、目前应用于尖孢镰孢菌辣椒专化型的检测方法主要是柯赫氏法则和分子生物学方法。柯赫氏法则的弊端在于回接实验时间较长、工作量大。分子生物学方法包括利用通用引物进行普通pcr，这种方法需结合系统发育分析，只能鉴定到种，缺乏对不同专化型的专一序列，无法对各专化型进行精准识别，且无法进行定量分析。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本发明提供了一种尖孢镰孢菌辣椒专化型精准检测引物及其应用。本发明选取尖孢镰孢菌辣椒专化型基因组5.8s核糖体its序列中的一段保守序列，针对该序列设计得到一种特异性引物，该引物可以扩增出片段单一的目的片段，而在其他尖孢镰孢菌近缘种真菌中均没有扩增信号，从而实现了对尖孢镰孢菌辣椒专化型的特异性检测。本发明检测模板dna浓度在0.0001ng/μl～100ng/μl范围内线性关系良好，可实现尖孢镰孢菌辣椒专化型的特异性定量检测，可以准确预测尖孢镰孢菌辣椒专化型的数量。使用本发明中的特异性引物定期监测土壤中尖孢镰孢菌辣椒专化型的含量，可为辣椒枯萎病的发生提供预测预报的作用。
2、为了实现上述目的，本发明采用了如下的技术方案：
3、本发明目的之一是提供一种尖孢镰孢菌辣椒专化型检测引物，其核苷酸序列如seq id no.1-seq id no.2所示。
4、本发明目的之二是提供一种所述尖孢镰孢菌辣椒专化型检测引物在尖孢镰孢菌辣椒专化型检测产品制备中的应用。
5、进一步的，所述应用中的尖孢镰孢菌辣椒专化型检测产品包括尖孢镰孢菌辣椒专化型检测试剂盒。
6、本发明目的之三是提供一种尖孢镰孢菌辣椒专化型检测试剂盒，其中包括所述尖孢镰孢菌辣椒专化型检测引物。
7、本发明目的之四是提供一种定量检测尖孢镰孢菌辣椒专化型的方法，所述方法包括使用所述尖孢镰孢菌辣椒专化型检测引物或所述尖孢镰孢菌辣椒专化型检测试剂盒。
8、进一步的，所述方法包括使用所述引物对样品进行pcr扩增的步骤；其中pcr扩增体系包括taq pcrmaster mix 10μl、上下游引物各1μl、dna模板2μl、ddh2o 6μl；pcr程序为94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，40个循环。
9、进一步的，所述方法包括使用所述引物对样品进行qpcr扩增的步骤；其中qpcr扩增体系包括tb green premix ex taq ii fast qpcr(2×)12.5μl、无核酸酶水8.5μl、上游引物1μl、下游引物1μl、dna模板2μl；qpcr扩增程序为95℃30s，然后进行50个循环反应，每个循环反应为95℃5s，60℃10s，于60℃时测定荧光值；各循环结束后自动收集并记录荧光信号。
10、本发明目的之五是提供一种所述尖孢镰孢菌辣椒专化型检测引物、所述尖孢镰孢菌辣椒专化型检测试剂盒或所述定量检测尖孢镰孢菌辣椒专化型的方法在尖孢镰孢菌辣椒专化型特异性检测中的应用。
11、本发明目的之六是提供一种所述尖孢镰孢菌辣椒专化型检测引物、所述尖孢镰孢菌辣椒专化型检测试剂盒或所述定量检测尖孢镰孢菌辣椒专化型的方法在辣椒种植中的应用。
12、本发明目的之七是提供一种所述尖孢镰孢菌辣椒专化型检测引物、所述尖孢镰孢菌辣椒专化型检测试剂盒或所述定量检测尖孢镰孢菌辣椒专化型的方法在辣椒枯萎病防治中的应用。
13、与现有技术相比，本发明的有益效果是：
14、1.本发明选取尖孢镰孢菌辣椒专化型的基因组5.8s核糖体its序列中的一段保守序列，针对该序列设计得到特异性引物和探针，设计得到的特异性引物可以扩增出片段单一的目的片段，而在其他尖孢镰孢菌近缘种真菌中均没有扩增信号，从而本发明利用所述引物能够实现对尖孢镰孢菌辣椒专化型的特异性检测。
15、2.本发明检测模板dna浓度在0.0001ng/μl～100ng/μl范围内线性关系良好，实现了尖孢镰孢菌辣椒专化型的特异性定量检测，可以准确预测尖孢镰孢菌辣椒专化型的数量。同时，本发明利用上述引物定期监测土壤中尖孢镰孢菌辣椒专化型的含量，为辣椒枯萎病的发生提供预测预报的作用。
1.一种尖孢镰孢菌辣椒专化型检测引物，其特征在于，其核苷酸序列如seq id no.1-seq id no.2所示。
2.权利要求1所述的尖孢镰孢菌辣椒专化型检测引物在尖孢镰孢菌辣椒专化型检测产品制备中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用中的尖孢镰孢菌辣椒专化型检测产品包括尖孢镰孢菌辣椒专化型检测试剂盒。
4.一种尖孢镰孢菌辣椒专化型检测试剂盒，其特征在于，其中包括权利要求1所述的尖孢镰孢菌辣椒专化型检测引物。
5.一种定量检测尖孢镰孢菌辣椒专化型的方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1所述的尖孢镰孢菌辣椒专化型检测引物或权利要求4所述的尖孢镰孢菌辣椒专化型检测试剂盒。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括使用所述引物对样品进行pcr扩增的步骤；其中pcr扩增体系包括taq pcr master mix 10μl、上下游引物各1μl、dna模板2μl、ddh2o 6μl；pcr程序为94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，40个循环。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括使用所述引物对样品进行qpcr扩增的步骤；其中qpcr扩增体系包括tb green premix ex taq ii fast qpcr(2×)12.5μl、无核酸酶水8.5μl、上游引物1μl、下游引物1μl、dna模板2μl；qpcr扩增程序为95℃30s，然后进行50个循环反应，每个循环反应为95℃5s，60℃10s，于60℃时测定荧光值；各循环结束后自动收集并记录荧光信号。
8.权利要求1所述的尖孢镰孢菌辣椒专化型检测引物、权利要求4所述的尖孢镰孢菌辣椒专化型检测试剂盒或权利要求5-7任一所述的定量检测尖孢镰孢菌辣椒专化型的方法在尖孢镰孢菌辣椒专化型特异性检测中的应用。
9.权利要求1所述的尖孢镰孢菌辣椒专化型检测引物、权利要求4所述的尖孢镰孢菌辣椒专化型检测试剂盒或权利要求5-7任一所述的定量检测尖孢镰孢菌辣椒专化型的方法在辣椒种植中的应用。
10.权利要求1所述的尖孢镰孢菌辣椒专化型检测引物、权利要求4所述的尖孢镰孢菌辣椒专化型检测试剂盒或权利要求5-7任一所述的定量检测尖孢镰孢菌辣椒专化型的方法在辣椒枯萎病防治中的应用。
