本发明涉及病毒检测，尤其涉及一种用于检测新型布尼亚病毒的试剂盒及其应用。
背景技术：
1、 发热伴血小板减少综合征病毒（severe fever with thrombocytopeniasyndrome bunyavirus，sftsv），又称“新型布尼亚病毒”，人类感染该病毒后会引起发热伴血小板减少综合征（sfts），其主要临床表现是高热、血小板减少、白细胞减少、胃肠道症状和高病死率。因此，针对环境和临床样本中该病毒的快速检测极为重要。
2、 crispr核酸检测通常指利用cas蛋白反式切割活性进行的核酸检测，简称反式crispr核酸检测。cas12、cas13可在crrna的介导下，特异性地识别相应的靶标，并触发反式切割活性，即非特异性地切割附近任意的单链寡核苷酸（也有报道单链核酸类似物也被如此切割）。反式crispr核酸检测所需的元件包括cas蛋白，向导rna以及反式切割报告分子。反式crispr核酸检测的核心仍旧是碱基配对原则，即向导rna的导向序列与靶标核酸配对，cas蛋白的作用在于它能与向导rna的同向重复序列（direct repeat，dr）结合，同时在向导rna的导向序列与靶标核酸配对后，能被激活反式切割活性。
3、 目前，关于sftsv的crispr核酸检测方法报道较少，且检测灵敏度较低。例如，专利cn117867167a公开了一种基于rpa-crispr/cas12a检测新布尼亚病毒的引物组及其应用，其最低检测拷贝数为10 copies/μl。
技术实现思路
1、为了解决现有的针对新型布尼亚病毒（sftsv）的crispr核酸检测方法灵敏度较低的技术问题，本发明提供了一种用于检测新型布尼亚病毒的试剂盒及其应用。本发明的试剂盒中采用了特定的引物对和crrna，能够实现较高的检测灵敏度和准确性。
2、本发明的具体技术方案为：
3、第一方面，本发明提供了一种用于检测新型布尼亚病毒的试剂盒，包括核酸扩增单元和crispr核酸检测单元，所述核酸扩增单元包括引物对，所述crispr核酸检测单元包括crrna、cas蛋白和反式切割报告分子；所述crrna的序列如seq id no.11所示，所述引物对包括如seq id no.6所示的上游引物和如seq id no.7所示的下游引物。
4、在采用crispr核酸检测技术进行病毒检测的过程中，用于核酸扩增的引物对以及用于crispr核酸检测的crrna的设计，均会影响检测灵敏度。但关于引物对和crrna的设计对灵敏度的影响，所涉及的因素错综复杂，目前尚未总结出明确的系统性规律表明怎样的引物对和crrna能够实现较高的检测灵敏度，其可预测性很差，这为引物对和crrna的设计带来了极大的技术难度。
5、 本发明中采用了特定的引物对（seq id no.6和seq id no.7），并配合特定序列的crrna（seq id no.11），在对新型布尼亚病毒（sftsv）进行检测时，具有较高的灵敏度，同时具有高度特异性。当引物对和crrna的设计不当时，均会对检测灵敏度产生不利影响。
6、作为优选，所述反式切割报告分子为5’-/6-fam/cccccccc/bhq1/-3’。
7、上述反式切割报告分子即cccccccc序列的两端分别连接有6-羧基荧光素（6-fam）和黑洞猝灭剂bhq1。
8、配合本发明中所采用的特定引物对和crrna，当采用上述反式切割报告分子时，能够获得较高的荧光强度，因而能够进一步提高检测灵敏度。
9、作为优选，所述cas蛋白为v-a型cas蛋白。
10、进一步地，所述v-a型cas蛋白为cas12a蛋白。
11、 进一步地，所述cas12a蛋白为fncas12a、lbcas12a、ercas12a、evcas12a 、lb5cas12a、hkcas12a、oscas12a、tscas12a、bbcas12a、bocas12a、lb4cas12a、cecas12a、prcas12a、csbcas12a、bhcas12a、sscas12a、lb3cas12a、bpcas12a、pdcas12a、bfcas12a、pccas12a、cmtcas12a、pecas12a、licas12a、lb2cas12a、pmcas12a、mbcas12a、eecas12a、csbcas12a、arcas12a、bscas12a、abcas12a 和ascas12a中的一种或多种。
12、作为优选，所述核酸扩增体系还包括转录酶、核酸扩增用酶、dntp和缓冲液。
13、 进一步地，所述核酸扩增用酶为重组酶聚合酶扩增技术（recombinasepolymerase amplification，rpa）、重组酶介导链替换核酸扩增技术（recombinase aidedamplification，raa）、酶促重组等温扩增技术（enzymatic recombinase amplification，era）或多酶恒温快速扩增技术（multienzyme isothermal rapid amplification，mira）中的核酸扩增用酶。
14、第二方面，本发明提供了所述试剂盒在非诊断目的的新型布尼亚病毒检测中的应用，包括以下步骤：
15、（1）配制包含引物对的核酸扩增混合物；
16、（2）配制包含crrna、cas蛋白和反式切割报告分子的crispr核酸检测混合物；
17、（3）将待检样本与核酸扩增混合物混合，进行核酸扩增，得到扩增产物；
18、（4）将扩增产物与crispr核酸检测混合物混合，得到混合体系，进行反应。
19、本发明的试剂盒可用于诊断目的的sftsv检测（如临床样本的检测），也可用于非诊断目的的sftsv检测（如非人体和动物体的环境样本的检测）。
20、采用本发明中的引物对和crrna体系，配合上述方法进行sftsv检测，能够在确保检测准确性（高灵敏度和高特异性）的同时，实现较短的检测时间。
21、作为优选，步骤（3）和（4）在同一反应管内进行；所述反应管的管盖下方设有储液腔；步骤（3）和（4）的具体过程包括：将核酸扩增混合物和待检样本添加在反应管的管体内，将crispr核酸检测混合物添加在储液腔内，进行核酸扩增后，将得到的扩增产物与crispr核酸检测混合物接触，进行反应。
22、上述为一管两步法crispr核酸检测方法，将核酸扩增和crispr核酸检测过程在同一反应管内进行，不用二次开盖加样，不仅能避免气溶胶污染发生，同时利用crispr技术能提升等温扩增检测的特异性，避免出现假阳性结果的风险。此外，还具有无需较为专业的设备，也无需较为专业的人员操作的优点，适合在资源有限的地点推广。
23、进一步地，将得到的扩增产物与crispr核酸检测体系接触的方式是离心、颠倒和/或振荡。
24、 作为优选，步骤（4）中，在所述混合体系中，cas蛋白的含量不低于500 nmol/l，crrna的含量不低于500 nmol/l，反式切割报告分子的含量为62.5~500 nmol/l。
25、 作为优选，步骤（1）中，所述核酸扩增混合物中，引物对的含量为0.1~1 μm。
26、作为优选，步骤（3）中，在进行核酸扩增前，向核酸扩增混合物中加入乙酸镁。
27、 作为优选，步骤（3）中，所述进行核酸扩增的温度为37~42℃，时间为10~30 min；步骤（4）中，所述进行反应的温度为37~48℃,时间为5~15 min。
28、进一步地，步骤（4）中，所述进行反应的温度为45~48℃。
29、与现有技术相比，本发明具有以下优点：
30、（1）本发明中通过采用特定的引物对、crrna和反式切割报告分子，三者配套使用，能够在sftsv的检测中实现较高的灵敏度和特异性。经试验，采用上述体系，当待测物的拷贝数低至12.5 copies/test（即2.5 copies/μl）时，仍能实现100%检出。
31、 （2）本发明采用特定的引物对、crrna和反式切割报告分子，配合一管两步法crispr核酸检测方法，能够在确保检测准确性的同时，在较短的时间内完成检测。
32、 （3）本发明采用一管两步法crispr核酸检测方法，能够避免气溶胶污染，提升等温扩增检测的特异性，从而避免出现假阳性的问题，同时还具有操作便捷、对设备和操作人员要求较低的特点。
1.一种用于检测新型布尼亚病毒的试剂盒，其特征在于，包括核酸扩增单元和crispr核酸检测单元，所述核酸扩增单元包括引物对，所述crispr核酸检测单元包括crrna、cas蛋白和反式切割报告分子；所述crrna的序列如seq id no.11所示，所述引物对包括如seq idno.6所示的上游引物和如seq id no.7所示的下游引物。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述反式切割报告分子为5’-/6-fam/cccccccc/bhq1/-3’。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述cas蛋白为v-a型cas蛋白。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述v-a型cas蛋白为cas12a蛋白。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸扩增体系还包括转录酶、核酸扩增用酶、dntp和缓冲液。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸扩增用酶为重组酶聚合酶扩增技术、重组酶介导链替换核酸扩增技术、酶促重组等温扩增技术或多酶恒温快速扩增技术中的核酸扩增用酶。
7.根据权利要求1所述试剂盒在非诊断目的的新型布尼亚病毒检测中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤（3）和（4）在同一反应管内进行；所述反应管的管盖下方设有储液腔；步骤（3）和（4）的具体过程包括：将核酸扩增混合物和待检样本添加在反应管的管体内，将crispr核酸检测混合物添加在储液腔内，进行核酸扩增后，将得到的扩增产物与crispr核酸检测混合物接触，进行反应。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤（4）中，在所述混合体系中，cas蛋白的含量不低于500 nmol/l，crrna的含量不低于500 nmol/l，反式切割报告分子的含量为62.5~500 nmol/l。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤（3）中，在进行核酸扩增前，向核酸扩增混合物中加入乙酸镁。
