本发明属于生物检测，具体涉及一种同时鉴别pedv经典株和变异株的引物组和试剂盒，更具体涉及一种快速同时鉴别猪流行性腹泻病毒经典株和变异株的rt-lamp引物组、试剂盒及检测方法。
背景技术：
1、猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus, pedv）是一种发生于猪的高度接触性肠道传染病的病原体。猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea, ped）的特征是各年龄阶段猪群出现腹泻，其中以一周龄内仔猪呕吐、腹泻、食欲下降和死亡为主要特征。猪是pedv的唯一自然宿主，pedv可感染从初生仔猪、育肥猪、母猪及公猪等各年龄阶段的猪群，其造成的危害与日龄有很大关系，对育肥猪及种猪的危害较小，可造成母猪的腹泻、无乳并影响其繁殖周期，但对哺乳仔猪，特别是7日龄内新生仔猪的危害相对较大。pedv的主要传染源是带毒或感染的猪，其次是污染的饲料及其包装袋、车辆、鞋及衣物等都可传播该病毒。粪-口传播是pedv的主要传播方式，近年来还发现母猪乳汁中检出该病毒，因此，母乳也可能是pedv一种传播方式。此外，也有报道指出，该病毒可能通过呼吸道传播，并能通过呼吸道分泌物排出。这意味着在同圈或邻圈的猪群中，病毒可能主要通过直接接触健康猪进行传播，也可能通过间接接触、饲喂被病毒污染的饲料和饮水等途径进行水平传播。
2、大量的基因组测序与分析发现，在临床感染中均发现了变异株pedv与经典株pedv。目前，流行的pedv毒株主要为变异毒株（g2基因型），与经典毒株（以cv777毒株为代表的g1基因型）在基因型和遗传进化上存在较大差异。此外，由于变异毒株和经典毒株在抗原性、免疫原性及保护性方面均存在较大差异，导致基于经典株pedv的疫苗对变异株pedv的保护力较差，导致临床上ped的防控存在较大困难。变异株pedv与经典株pedv在致病性存在较大差异，田间存在变异毒株与经典毒株感染，难以通过症状和病变进行鉴别，需要实验室诊断才能区分毒株的基因型。当前，pedv的实验室诊断方法主要包括：rt-pcr、实时荧光定量rt-pcr、elisa、中和试验、病毒分离与鉴定、免疫电镜、免疫荧光等。但目前的诊断方法无法直接鉴别pedv毒株是经典毒株还是变异株。传统的鉴别pedv经典毒株和变异株的方法是通过基因测序及比对分析，该方法费时费力。因此，迫切需要一种非诊断目的的既可检测pdev又能够鉴别是经典株还是变异株的快速检测方法。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本发明的目的之一是提供一种同时鉴别pedv经典株和变异株的引物组。
2、本发明的目的之二在于提供一种快速同时检测猪流行性腹泻病毒及鉴别猪流行性腹泻病毒经典株与变异株的rt-lamp试剂盒。
3、本发明的目的之三在于提供一种非诊断目的的检测猪流行性腹泻病毒及鉴别猪流行性腹泻病毒经典株与变异株的rt-lamp检测方法。
4、本发明的目的之四在于提供一种rt-lamp试剂盒在非诊断目的的检测猪流行性腹泻病毒及鉴别猪流行性腹泻病毒经典株与变异株中的应用。
5、本发明所采取的技术方案为：
6、本发明提供一种同时鉴别pedv经典株和变异株的rt-lamp引物组，所述rt-lamp引物组包括引物组ⅰ和引物组ⅱ；
7、所述引物组ⅰ包括外引物对ⅰ pedv-lm-f3和pedv-lm-b3、内引物对ⅰ pedv-lm-fip和pedv-lm-bip；所述引物组ⅰ的核苷酸序列分别如seq id no.1至seq id no.4所示。
8、所述引物组ⅱ包括外引物对ⅱ pedv-ls-f3和pedv-ls-b3、内引物对ⅱ pedv-ls-fip和pedv-ls-bip；所述引物组ⅱ的核苷酸序列分别如seq id no.5至seq id no.8所示。具体地，各序列核苷酸具体如下所示（5’-3’）：
9、pedv-lm-f3：tctgtgatgggccgacag（seq id no.1）；
10、pedv-lm-b3：ccagtgccagatgaagcatt（seq id no.2）；
11、pedv-lm-fip：cctgtacgccagtagcaaccttgagcaccaact
12、ggtgtaacg（seq id no.3）；
13、pedv-lm-bip：atttcgtcacagtcgccaaggcgactgaacga
14、ccaacacgt（seq id no.4）；
15、pedv-ls-f3：aaatttaatgttcaggcacct（seq id no.5）；
16、pedv-ls-b3：gtggccttatgtaaataaagct（seq id no.6）；
17、pedv-ls-fip：actagcagtttcaatgcctgtggttacctaccta
18、gtatgaactct（seq id no.7）；
19、pedv-ls-bip：ggcgttcatggtatttttctcagcctaggatcaa
20、acggctcttg（seq id no.8）。
21、进一步地，用于检测pedv经典株和变异株的通用rt-lamp检测引物组为引物组ⅰ的2对特异性引物，即外引物对ⅰ pedv-lm-f3和pedv-lm-b3、内引物对ⅰ pedv-lm-fip和pedv-lm-bip；用于鉴别pedv经典株和变异株的rt-lamp检测引物组为引物组ⅱ的2对特异性引物，即外引物对ⅱ pedv-ls-f3和pedv-ls-b3、内引物对ⅱ pedv-ls-fip和pedv-ls-bip。
22、本发明还提供一种同时鉴别pedv经典株和变异株的试剂盒，包括上述的rt-lamp引物组、逆转录酶、rt-lamp反应液、阳性对照和阴性对照。
23、进一步地，包括的外引物对ⅰ和内引物对ⅰ的摩尔比为1:8。
24、进一步地，包括的外引物对ⅱ和内引物对ⅱ的摩尔比为1:8。
25、本发明还提供一种非诊断目的的同时检测pedv经典株和变异株的方法，包括以下步骤：
26、（1）rna提取及反转录：从样品中提取病毒核酸并用反转录试剂盒将rna反转录为cdna；
27、（2）rt-lamp反应：利用上述试剂盒与样本cdna混合配制成rt-lamp扩增反应体系进行rt-lamp反应；
28、（3）结果判断：在扩增反应后的体系中加入荧光饱和染料进行可视化rt-lamp检测，用琼脂糖凝胶验证可视化rt-lamp检测结果。
29、进一步地，所述rt-lamp反应体系包括通用lamp反应体系和鉴别lamp反应体系；其中，
30、所述通用lamp反应体系以25µl计包括：
31、10×等温扩增缓冲液（isothermal amplification buffer）（内含20mm的mgso4）2.5 µl，
32、100mm mgso41.0µl，
33、10mm dntp2.5µl，
34、8000u/ml bst2.0 dna聚合酶（bst2.0 dna polymerase）1µl，
35、5µm外引物对ⅰ2.0µl，
36、40µm内引物对ⅰ2.0µl，
37、样本cdna2.5 µl，
38、灭菌蒸馏水11.5 µl；反应的程序为：65℃反应40min，80℃反应20min灭活。
39、所述鉴别lamp反应体系以25µl计包括：
40、10×等温扩增缓冲液（内含20 mm的mgso4）2.5 µl，
41、100mm mgso41.5µl，
42、10mm dntp3.5µl，
43、8000u/ml bst2.0 dna polymerase1.0µl，
44、5µm外引物对ⅱ2.0µl，
45、40µm内引物对ⅱ2.0µl，
46、样本cdna2.5 µl，
47、灭菌蒸馏水10.0µl；反应的程序为：65℃反应30min，80℃反应20 min灭活。
48、本发明还提供一种上述试剂盒在非疾病诊断目的的鉴别pedv经典株和变异株中的应用。
49、相对于现有技术的有益效果：
50、1.本发明以pedv较为保守的m基因为目的片段并构建标准质粒，建立了pedv通用rt-lamp快速检测方法；以pedv的s基因为目的片段并构建标准质粒，建立了pedv鉴别rt-lamp快速检测方法；不仅可避免pedv变异株的漏检误检，还可鉴别pedv经典株和变异株，对了解pedv的流行情况及pedv感染的防控工作具有重要意义。
51、2.本发明针对pedv经典株和变异株以rt-lamp法进行检测，其中采用了专门的成套引物，包含该成套引物的试剂盒，以及采用该试剂盒的检测方法；该试剂盒使用便捷，短时间内即可完成病原菌的检测；不需要大型复杂昂贵的仪器；结果鉴定方便直观，反应结束后无需开盖额外添加试剂，可避免开盖导致的后续气溶胶污染而造成假阳性的问题，无需后续核酸电泳等繁琐过程，快速、准确、高效，40min即可完成扩增及结果判定全过程；检测特异性好、灵敏性高，经实验对比测试，本发明检测pedv毒株及经典株和变异株的敏感性最低可检测到102拷贝，灵敏度是传统pcr方法的100倍-1000倍。
52、3.本发明结果可靠，成本相对较低，具有简单、快速、特异、灵敏的特点，可满足快速检测的需求，为pedv经典株和变异株的快速检测提供依据。
1.一种同时鉴别pedv经典株和变异株的rt-lamp引物组，其特征在于，所述rt-lamp引物组包括引物组ⅰ和引物组ⅱ；
2.根据权利要求1所述的同时鉴别pedv经典株和变异株的rt-lamp引物组，其特征在于，用于检测pedv经典株和变异株的通用rt-lamp检测引物组为引物组ⅰ的2对特异性引物；用于鉴别pedv经典株和变异株的rt-lamp检测引物组为引物组ⅱ的2对特异性引物。
3.一种同时鉴别pedv经典株和变异株的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的rt-lamp引物组。
4.根据权利要求3所述的一种同时鉴别pedv经典株和变异株的试剂盒，其特征在于，还包含逆转录酶、rt-lamp反应液、阳性对照和阴性对照。
5.根据权利要求3所述的一种同时鉴别pedv经典株和变异株的试剂盒，其特征在于，所述外引物对ⅰ和内引物对ⅰ的摩尔比为1:8。
6.根据权利要求3所述的一种同时鉴别pedv经典株和变异株的试剂盒，其特征在于，所述外引物对ⅱ和内引物对ⅱ的摩尔比为1:8。
7.一种非诊断目的的同时检测pedv经典株和变异株的方法，其特征在于，包括以下步骤：
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述rt-lamp反应体系包括通用lamp反应体系和鉴别lamp反应体系；其中，
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述通用rt-lamp反应的程序为：65℃反应40min，80℃反应20min灭活；所述鉴别rt-lamp反应的程序为：65℃反应30 min，80℃反应20min灭活。
10.一种如权利要求3-6任一项所述的试剂盒在非疾病诊断目的的鉴别pedv经典株和变异株中的应用。
