本发明大体上涉及表达刺激免疫系统的分子的溶瘤单纯疱疹病毒(oncolyticherpes simplex virus，ohsv)载体。序列表、表格或计算机程序的引用电子序列表(viro_416pc_seqlist.text.xml；大小：10.9比特；创建日期：2023年1月29日)的内容通过引用整体并入本文。
背景技术：
1、恶性肿瘤严重威胁人类生命健康。尽管存在各种标准治疗选项，如手术、放射疗法、化学疗法、目标疗法和免疫疗法(包括免疫检查点抑制剂)，但大部分患晚期肿瘤的患者仍然预后不佳。目前，肿瘤免疫疗法在治疗肿瘤方面已取得突破性进展。免疫目标药物疗法(例如免疫检查点抑制)和免疫细胞疗法(例如嵌合抗原受体t细胞(chimeric antigenreceptor t-cell，car-t))已引起抗肿瘤疗法领域的变化。然而，在目前经批准的检查点抑制剂的适应症中，单一药物有效率仅为约30％(jiang等人，2020，progress andchallenges in precise treatment of tumors with pd-1/pd-l1blockade.frontiersin immunology，11(3月))；而car-t疗法主要仅靶向b细胞肿瘤高度表达的分化簇抗原19(cluster of differentiation 19，cd19)和b细胞成熟抗原(b cell maturationantigen，bcma)。在实体肿瘤中的临床有效性尚待确(long等人，2018，car t cell therapyof non-hematopoietic malignancies:detours on the road to clinicalsuccess.frontiers in immunology，9(12月)，2740)。在有明确长期迹象表明免疫疗法的益处的情况下，仍然存在多种恶性肿瘤。
2、对于在标准治疗后复发且用标准治疗难以治疗的恶性肿瘤，临床上尚无有效的治疗方法，因此这种情况下的患者可能由于肿瘤广泛转移或侵害重要器官造成患者更快死亡。因此，这种患者对有效治疗的需求极大程度上未能满足，导致迫切需要开发新型治疗方法来控制疾病进展和延长患者存活期。
3、本发明克服当前癌症疗法(包括免疫疗法)的缺点，并且进一步提供另外的意想不到的益处。
4、对于背景技术部分中述及的所有内容，仅因为其在背景技术部分被述及，并不导致其为必要的现有技术，且不应假定其为先前技术。顺沿这种思路，除非明确表明为现有技术，否则背景技术部分中述及的或与此类内容相关的现有技术中认知的问题不应当视为现有技术。背景技术部分中述及的任何内容反而应当视为发明人对于特定问题的解决方法的一部分，其自身也可以是发明性的。
5、
技术实现要素：
简述
6、简言之，本发明涉及用重组单纯疱疹病毒载体治疗癌症和组合物和方法。在本发明的一个实施方式中，提供重组单纯疱疹病毒，其包含经修饰的溶瘤疱疹病毒基因组，其中经修饰的疱疹病毒基因组包含至少一个可操作地连接至icp34.5基因的第一拷贝的mirna目标序列，且所述icp34.5基因的第二拷贝包含失活突变。在各种实施方式中，重组病毒可包含一至十个可操作地连接至icp34.5基因的第一拷贝的mirna目标序列。
7、在另外的实施方式中，mirna目标序列可结合至少两个不同的mirna(例如mir-124、mir-124*和mir-143中的一个或多个)。在某些实施方式中，mir目标序列包括seq idno.2(mir-124结合序列)；seq id no.3(mir-143结合序列)；seq id no.9(mir-223结合序列)；和seq id no.10(mir-125b结合序列)。可用于本发明的其他实施方式中的其他mirna目标序列包括如wo2020/113151中所述的例如mlr-122、mir-127、mir-128、mir-129、mir-129*、mir-132、mlr-133a、mlr133b、mir-135b、mir-136、mir-136*、mir-137、mir-139-5p、mlr-145、mir-154、mir-184、mir-188、mir-204、mlr216a、mir-299、mir-300-3p、mir-300-5p、mir-323、mir-329、mir-337、mir-335、mir-341、mir-369-3p、mir-369-5p、mir-376a、mir-376a*、mir-376b-3p、mir-376b-5p、mir-376c、mir-377、mir-379、mir-379*、mir-382、mir-382*、mir-409-5p、mir-410、mir-411、mir-431、mir-433、mir-434、mir-451、mir-466b、mir-485、mir-495、mir-539、mir-541、mir-543*、mir-551b、mir-758及mir-873，wo2020/113151通过引用整体并入本文。
8、在又一个实施方式中，重组疱疹病毒可进一步包含至少一种编码非病毒蛋白的核酸。非病毒蛋白的实例包括免疫刺激因子、抗体和检查点阻断肽(例如来源于pd-1或来源于pd-l1或pd-l2的肽，或针对检查点抑制剂的抗体，如抗pd-1、抗pd-l1、抗pd-l2或抗ctla-4)，其中至少一种核酸可操作地连接至强启动子(例如病毒启动子，如cmv，或其他启动子，如ef-1α或cag)。另选地，所述至少一种核酸可操作地连接至肿瘤特异性或肿瘤相关启动子(例如cea启动子、cxcr4启动子、htert启动子、生存素启动子、brms1启动子、mcm5启动子或ran启动子)。在特别优选的实施方式中，非病毒蛋白为il12、il15、il15受体α亚单位中的一种或全部。这种序列的代表性实例包括seq id no.4(il12)；seq id no.5(il15)；和seq idno.6(il15受体α亚单位)。
9、在又一个实施方式中，重组单纯疱疹病毒进一步包含编码具有增强的融合性(与相似的野生型病毒相比)的糖蛋白的核酸序列。实例包括多种转入基因(例如来自长臂猿白血病病毒(gibbon ape leukemia virus，galv)的融合糖蛋白)和/或增强hsv融合的突变，包括例如糖蛋白b、糖蛋白k和/或ul20中的截断或突变。
10、在又其他实施方式中，重组疱疹病毒可进一步包含可操作地连接至icp47基因的第一拷贝的icp27启动子序列，其中icp47基因的天然启动子包含失活缺失。
11、另外在其他实施方式中，重组疱疹病毒可在icp4基因的至少一个拷贝中进一步包含失活突变。
12、另外在其他实施方式中，重组疱疹病毒可进一步包含可操作地连接至icp27基因的第一拷贝的肿瘤特异性启动子，其中天然icp27启动子包含失活突变。
13、还提供包含本文所述的重组疱疹病毒的治疗组合物，以及使肿瘤细胞裂解的方法及治疗个体的癌症的方法，其包含向个体施用本文所述的一种重组疱疹病毒中的步骤。
14、已提供此“发明内容简述”以按简化形式介绍某些在下文[实施方式]中进一步详细描述的概念。除另外明确陈述以外，此“发明内容简述”并非旨在确定所请求保护内容的关键特征或基本特征，也非旨在限制所请求保护内容的范围。
15、一个或多个实施方式的详细内容如下所述。结合一个示例性实施方式所说明或描述的特征可与其他实施方式的特征组合。因此，本文所述的各种实施方式中的任何实施方式可以组合以提供更多的实施方式。必要时，可修改实施方式的各方面以采用如本文所指出的各种专利、专利申请和专利公开的概念，从而再提供更多的实施方式。其他特征、目标和优势将从说明书、附图和权利要求中显而易见。
16、附图简述
17、本发明示例性的特征，其性质及各种优势将从附图和以下各种实施方式的详述中显而易见。参考附图描述非限制性和非穷尽的实施方式，其中除非另外规定，否则相似的标签或参考编号是指各种视图中的相似部分。附图中组件的大小和相对位置不一定按比例绘制。例如，各组件的形状被选中、放大并定位以提高附图清晰度。所绘制的组件选择特定形状以易于在附图中识别。下文参考附图描述一或多个实施方式，其中：
18、图1概略地描绘如由vg2062(也称为vg203)的双链脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，dna)元件的总体结构组织所例示的转录和翻译双重调节的(transcription and translation dual regulated，ttdr)系统。
19、图2为展现微小rna介导的病毒基因表达控制的图表(上图)和表格(下图)。
20、图3为三个重组溶瘤hsv之间的细胞-细胞融合表现型的比较。
21、图4描绘9种不同的泌尿肿瘤细胞系中vg2062icp27dna和宿主细胞cxcr4mrna的基于qpcr的定量。
22、图5描绘在一组9种不同的泌尿肿瘤细胞系上vg2062的复制动力学。
23、图6描绘在一组10种不同的泌尿肿瘤细胞系上vg2062和vg161的ic50细胞毒性值(以moi测量)。
24、图7描绘在感染一组10种不同的泌尿肿瘤细胞系之后由vg2062和vg161分泌的人类il-12和人类il-15载荷的基于elisa的定量。
25、图8描绘来自用三次剂量注射的vg2062处理的负载a549肿瘤的免疫功能不全小鼠的肿瘤体积。
26、图9描绘来自用递增单次剂量的vg2062处理的负载pc3肿瘤的免疫功能不全小鼠的肿瘤体积。
27、图10描绘用递增单次剂量的vg2062处理的负载du145肿瘤的免疫功能不全小鼠的肿瘤体积。
28、图11描绘来自用低剂量或高剂量单次注射的vg2062处理的负载um-uc-3肿瘤的免疫功能不全小鼠的肿瘤体积。
29、图12描绘来自用低剂量或高剂量单次注射vg2062处理的负载bt-474肿瘤的免疫功能不全小鼠的肿瘤体积。
30、图13描绘来自用低剂量或高剂量三次注射mvg2031处理的负载emt-6肿瘤的具有免疫能力的小鼠的肿瘤体积。
31、图14描绘来自用mvg2031、用抗pd-1抗体或用mvg2031与抗pd-1抗体二者的组合处理的负载emt-6肿瘤的具有免疫能力的小鼠的肿瘤体积。
32、图15描绘来自用低剂量单次注射mvg2031、高剂量单次注射mvg2031、低剂量三次注射mvg2031或高剂量三次注射mvg2031处理的负载renca肿瘤的具有免疫能力的小鼠的肿瘤体积。
33、图16a和图16b描绘来自在左侧(图16b)和右侧(图16a)胁腹两侧植入renca肿瘤并且用mvg2031、用抗pd-1抗体或用mvg2031与抗pd-1抗体二者的组合处理的具有免疫能力的小鼠的肿瘤体积。
34、图17描绘来自用低剂量或高剂量单次注射vg2062处理的负载a-498肿瘤的免疫功能不全小鼠的肿瘤体积。
35、图18描绘角膜划破并且接种了野生型hsv-1病毒株17+或者低剂量或高剂量vg2062之后的小鼠眼睛。
技术实现思路
1.一种包含经修饰的溶瘤疱疹病毒基因组的重组单纯疱疹病毒，其中所述经修饰的疱疹病毒基因组包含至少一个可操作地连接至icp34.5基因的第一拷贝的mirna目标序列，且所述icp34.5基因的第二拷贝包含失活突变，还进一步包含用立刻早期基因启动子，如可操作地连接至icp47基因的icp4、icp0或icp27调节序列，替换icp47启动子，且其中所述icp47基因包含天然icp47调节序列中的失活缺失。
2.如权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其进一步包含所述病毒基因组的一个rl和一个rs区的缺失。
3.如权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其包含二至十个可操作地连接至所述icp34.5基因的所述第一拷贝的mirna目标序列。
4.如权利要求3所述的重组单纯疱疹病毒，其中所述mirna目标序列插入至所述icp34.5基因的所述第一拷贝的3'非编码区中。
5.如权利要求3所述的重组单纯疱疹病毒，其中所述二至十个mirna目标序列与至少两个不同的mirna结合。
6.如权利要求5所述的重组单纯疱疹病毒，其中所述mirna选自由mir-124、mir-124*和mir-143组成的组。
7.如权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其中所述经修饰的疱疹病毒基因组在病毒基因icp0、icp4和/或icp27中包含另外的突变或修饰。
8.如权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其中通过用肿瘤特异性启动子替换天然病毒启动子修饰所述病毒。
9.如权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其中所述修饰为用肿瘤特异性启动子替换icp27的整个启动子调节区。
10.如权利要求9所述的重组单纯疱疹病毒，其中用cxcr4启动子替换所述icp27启动子。
11.如权利要求7所述的重组单纯疱疹病毒，其中所述修饰为rl或rs的一个拷贝的缺失。
12.如权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其进一步包含至少一种编码非病毒蛋白的核酸，所述非病毒蛋白选自由免疫刺激因子、抗体和检查点阻断肽组成的组，其中所述至少一种核酸可操作地连接至通用或肿瘤特异性启动子。
13.如权利要求11所述的重组单纯疱疹病毒，其中所述非病毒蛋白选自由il12、il15、il15受体α亚单位、ctla-4拮抗剂、pd-1拮抗剂、pd-l1拮抗剂和/或pd-l2拮抗剂组成的组。
14.如权利要求12所述的重组单纯疱疹病毒，其中所述通用启动子为cmv。
15.如权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其进一步包含编码糖蛋白b的融合形式的核酸序列。
16.如权利要求14所述的重组单纯疱疹病毒，其中所述糖蛋白b可经发生于氨基酸876之后的缺失截断。
17.如权利要求1至15中任一项所述的重组单纯疱疹病毒，其中所述溶瘤疱疹病毒为hsv-1。
18.一种抑制肿瘤细胞的方法，其包含向肿瘤细胞提供治疗有效量的如权利要求1至17中任一项所述的重组单纯疱疹病毒。
19.如权利要求18所述的方法，其进一步包含向所述细胞提供ctla-4、pd-1、pd-l1和/或pd-l2拮抗剂的步骤。
20.一种治疗组合物，其包含如权利要求1至17中任一项所述的重组单纯疱疹病毒和药学上可接受的载体。
21.如权利要求20所述的治疗组合物，其进一步包含ctla-4、pd-1、pd-l1和/或pd-l2拮抗剂。
22.一种治疗患癌症个体的癌症的方法，其包含施用治疗有效量的如权利要求20所述的组合物的步骤。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述癌症表达高水平的生物标记物，如cxcr4。
24.如权利要求22所述的方法，其中所述癌症为泌尿癌症。
25.如权利要求22所述的方法，其进一步包含向所述个体施用ctla-4、pd-1、pd-l1和/或pd-l2拮抗剂的步骤。
