背景技术：
1、免疫治疗已成为癌症治疗的基石，其包括旨在通过对扩增的天然循环或遗传工程化的细胞毒性淋巴细胞的过继转移来释放、指导和增强患者自身的免疫系统的多种策略。尽管在所述领域中有最新进展，但是当前的过继免疫治疗仍面临若干挑战。例如，许多过继免疫治疗不能从外周血产生足够水平的具有临床或治疗价值的工程化的细胞毒性淋巴细胞，或者不能均匀地工程化效应细胞，或者不能为患者提供持续、持久的治疗效果，从而导致肿瘤复发和其他并发症。因此，对于提供更有效、持久且更安全的过继免疫治疗选择(包括以供患有白血病或淋巴瘤(包括急性或慢性白血病)的患者以及可从过继免疫治疗中获益的其他患者使用)的细胞组合物存在显著需求。在各个方面和实施方案中，本发明解决了这些需要。
技术实现思路
1、在各个方面和实施方案中，本发明提供了一种分离的细胞组合物，所述分离的细胞组合物适合于过继免疫治疗和/或t细胞的遗传工程化。本发明进一步提供了制造所述细胞组合物的方法和利用所述细胞组合物治疗的方法。所述组合物包含在药学上可接受的载体中的至少约106个对一种或多种靶肽抗原具有特异性的cd8+ t细胞，并且所述组合物包含t记忆干细胞(tscm)。在各种实施方案中，所述cd8+ t细胞是至少约1％的t记忆干细胞。在一些实施方案中，分离t记忆干细胞，从而制备基本上包含t记忆干细胞(例如，70％至100％的tscm)的组合物。由于存在显著水平的tscm，本发明的组合物可提供稳健且持久的过继治疗。所述细胞组合物不必包含表达嵌合抗原受体或重组tcr的t细胞，并且因此在各种实施方案中，提供了常常产生耗尽更彻底的t细胞表型和持久性较差的应答以及更大的毒性的这些技术的替代方法。在其他实施方案中，所述tscm被用于重组表达嵌合抗原受体或异源tcr，从而制备具有高增殖能力和耗尽更低的表型的工程化t细胞。
2、在各种实施方案中，所述细胞组合物包含至少1％或至少15％的t记忆干细胞和约106个对靶肽抗原具有特异性的cd8+ t细胞，或至少约107个、至少约108个或至少约109个或至少约1010个对靶肽抗原具有特异性的cd8+ t细胞，以提供稳健的靶细胞破坏和体内长持久性。例如，为治疗急性髓性白血病(aml)或骨髓增生异常综合征，所述细胞组合物可包含对wt1、prame、生存素(survivin)和细胞周期蛋白a1肽抗原等具有特异性的t细胞。
3、在各种实施方案中，所述细胞组合物包含约1％至约50％的t记忆干细胞，或约5％至约25％的t记忆干细胞。在各种实施方案中，所述t细胞是至少5％的t记忆干细胞，或者所述t细胞是至少约10％的t记忆干细胞，或者所述t细胞是至少20％的t记忆干细胞或至少25％的t记忆干细胞，其提供具有显著增殖潜力以及免疫重建能力和寿命的过继免疫治疗组合物。
4、在各种实施方案中，所述组合物中大于95％的cd8+ t细胞包含记忆表型。在各种实施方案中，除tscm外，记忆表型还包含中枢记忆t细胞(tcm)、效应记忆t细胞(tem)和效应记忆ra+ t细胞(temra)中的一者或多者(或全部)。在一些实施方案中，至少80％的记忆表型是tscm、tcm和tem。
5、在各种实施方案中，除tscm外，所述组合物中的cd8+ t细胞还包含中枢记忆t细胞和效应记忆t细胞。在各种实施方案中，所述组合物中的t细胞(和/或对靶抗原具有特异性的t细胞)是至少约30％的中枢记忆t细胞或效应记忆细胞，或者在一些实施方案中是至少约50％的中枢记忆t细胞或效应记忆t细胞，或者在一些实施方案中是至少约70％的中枢记忆t细胞或效应记忆t细胞，或者在一些实施方案中是至少约80％的中枢记忆t细胞或效应记忆t细胞，或者在一些实施方案中是至少约90％的中枢记忆t细胞或效应记忆t细胞。在一些实施方案中，对一种或多种靶抗原具有特异性的cd8+t细胞是至少50％的中枢记忆t细胞和效应记忆t细胞，或者在一些实施方案中是至少80％的中枢记忆t细胞和效应记忆t细胞。在一些实施方案中，tscm与tcm的组合是所述cd8+ t细胞的约40％至约70％。
6、在一些实施方案中，所述细胞组合物包含少于约20％或少于约10％的终末分化记忆t细胞(例如，temra细胞)和少于约30％的初始细胞，或者在一些实施方案中少于约15％、或者在一些实施方案中少于约5％或者在一些实施方案中少于1.5％的初始细胞。所述细胞表型可使用利用顺磁性人工抗原呈递细胞(aapc)和重组t细胞生长因子混合物的富集和扩增过程来创建和/或控制。
7、在各种实施方案中，所述细胞组合物是至少约70％、或至少约80％、或至少约90％的cd8+或cd4- t细胞(例如，cd3+cd8+或cd3+cd4-细胞)。例如，所述分离的细胞组合物的特征可以是具有少于约10％或少于约5％的cd4+ t细胞。当离体扩增cd8+ t细胞时，cd4+细胞具有使cd8+细胞过度生长并竞争生长信号的趋势，并且外源性cd4+细胞对于稳健且持久的体内应答而言不是必需的。
8、在各种实施方案中，所述抗原特异性t细胞在激活后显示出多功能性表型。在一些实施方案中，至少10％的cd8+ t细胞、或者在一些实施方案中至少20％的cd8+ t细胞、或者在一些实施方案中至少40％的cd8+ t细胞在激活后显示出多功能性表型。例如，t细胞在激活后对以下的两者或更多者呈阳性：针对il-2、ifn-γ产生、tnf-α产生和cd107a的细胞内染色。在各种实施方案中，至少20％的抗原特异性t细胞显示出这些标志物中的至少两者。在各种实施方案中，至少20％的抗原特异性t细胞显示出这些标志物中的至少三者，或者在一些实施方案中，显示出这些标志物中的全部四者。在各种实施方案中，至少5％的cd8+ t细胞是多抗原性的，这意味着cd8+ t细胞能够在体外或体内针对多种肿瘤或病毒抗原产生应答。
9、在各种实施方案中，所述细胞组合物还包含γδt细胞。γδt细胞在其表面上具有独特的t细胞受体(tcr)。γδt细胞可在识别脂质抗原和磷酸抗原中起作用，并且可提供非hla依赖性的抗病原体和抗肿瘤机制。此外，γδt细胞可为cd8+细胞提供帮助。已经观察到造血干细胞移植(hsct)背景下γδt细胞的临床意义，并且特别是移植后γδt细胞的较高频率与有利的结果相关。
10、根据各种实施方案的细胞组合物可通过富集和扩增过程进行制备。在一些实施方案中，对一种或多种靶抗原(例如肿瘤相关抗原或病毒相关抗原)具有特异性的cd8+细胞被富集。即使当源淋巴细胞中主要为初始细胞时，这种细胞群体也能够在培养中快速扩增，以达到本文中所述的细胞组成。富集可使用顺磁性珠进行以主动选择细胞群体，并且由于t细胞表面受体的强效磁聚集，它可具有激活初始细胞和其他t细胞群体的额外优势。例如，顺磁性珠或纳米颗粒可含有呈递肽抗原的单体或多聚的(例如，二聚的)hla配体，以及在相同或不同颗粒上的共刺激信号，如cd28的激动剂(例如，cd28的抗体激动剂)。在一些实施方案中，cd28+细胞也被富集，其可与抗原特异性富集同时进行。
11、在各种实施方案中，所述靶肽抗原是肿瘤或癌症相关抗原，包括肿瘤来源的、肿瘤特异性抗原和新生抗原。对肿瘤相关抗原具有特异性的t细胞常常非常罕见，并且在许多情况下在健康个体的外周血中检测不到。这常常是在病毒特异性t细胞与肿瘤抗原特异性t细胞之间观察到的区别。
12、在一些实施方案中，所述靶肽抗原包括至少一种与病原体相关或来源于病原体的抗原，所述病原体如病毒性、细菌性、真菌性或寄生性病原体。例如，至少一种肽抗原可与hiv、肝炎(例如，乙型、丙型或丁型)cmv、eb病毒(ebv)、流感、疱疹病毒(例如，hsv 1或2或水痘带状疱疹)和腺病毒相关。例如，cmv是在器官移植患者中发现的最常见的病毒性病原体，并且是接受骨髓或外周血干细胞移植的患者发病率和死亡率的主要原因。已知病毒激活与癌症生物学有牵连。
13、在其他实施方案中，所述细胞组合物包含对肿瘤相关抗原具有特异性的t细胞，其中病原体相关的抗原特异性t细胞作为旁观者细胞提供。其他旁观者细胞包括γδt细胞。特别地，通过富集hla肽和抗cd28，旁观者细胞将被富集并被扩增，特别是当使用能够在不存在抗原特异性激活的情况下驱动这些细胞的一些非特异性扩增的t细胞生长因子混合物时。在这些实施方案中，虽然所述组合物中大部分是对靶肽具有特异性的t细胞(例如，从5％到75％)，但其余的t细胞(从约0.25％到约25％)提供了一些针对常见病原体的免疫系统重建，这在移植后特别有益或在具有病毒病因学的癌症中是有益的。
14、一些实施方案在扩增期间采用影响t细胞的增殖和/或分化的t细胞生长因子。特别有用的细胞因子包括mip-1β、il-1β、il-2、il-4、il-6、il-7、il-10、il-21和inf-γ。在这些或其他实施方案中，所述细胞是在包含选自mip-1β、il-1β和il-6的一种、两种或三种细胞因子的细胞因子混合物存在下在培养中扩增的。在一些实施方案中，所述细胞因子进一步包含il-10。在一些实施方案中，所述生长因子包含il-2、il-4、il-6、inf-γ和il-1β或者基本上由il-2、il-4、il-6、inf-γ和il-1β组成。细胞可在培养中扩增1至4周，如约10天至约21天。
15、在其他方面中，本发明提供了用于制造细胞组合物的方法，所述方法包括通过用如本文中所述的aapc富集和扩增。特别地，在从源淋巴细胞(例如，来自健康供体或来自需要过继免疫治疗的患者)中耗减cd4+细胞后，针对对靶肽抗原具有特异性的t细胞、以及在一些实施方案中针对cd28+细胞富集抗原特异性cd8+ t细胞。靶细胞可利用纳米颗粒或微颗粒aapc(如通过磁场诱导的细胞表面受体聚集离体激活t细胞的超顺磁性纳米颗粒)进行富集。包括乳胶或其他基于聚合物的纳米颗粒在内的其他材料也可用于使细胞表面受体聚集(无磁性诱导的聚集)。然后，可将富集的t细胞快速地离体扩增，包括使用重建的t细胞生长因子(例如，包含选自mip-1β、il-1β、il-2、il-4、il-6、il-7、il-10、il-12、il-15、il-21、ifn-γ的因子)。在一些实施方案中，所述细胞是在选自mip-1β、il-1β、il-6和il-10的一种、两种或三种细胞因子存在下在培养中扩增的。在一些实施方案中，所述生长因子包含il-2、il-4、il-6、inf-γ和il-1β或者基本上由il-2、il-4、il-6、inf-γ和il-1β组成。在各种实施方案中，这些细胞因子与人工或天然抗原呈递细胞结合使用以扩增抗原特异性t细胞。
16、在其他方面中，本发明提供了用于过继细胞治疗的方法，包括用于治疗患有癌症的患者和/或经历了同种异体干细胞移植的患者的方法，所述患者接受了或未接受淋巴细胞耗减治疗、减瘤治疗、免疫调节治疗(在施用细胞治疗之前)。所述细胞治疗可在治疗后进一步提供或不提供细胞因子支持。在一些实施方案中，所述患者患有血液系统癌症，所述血液系统癌症在一些实施方案中在同种异体干细胞移植后复发。在一些实施方案中，所述患者患有急性髓性白血病(aml)或骨髓增生异常综合征。例如，在一些实施方案中，所述细胞组合物包含对wt1、prame、生存素和细胞周期蛋白a1肽抗原具有特异性的t细胞。然而，在其他实施方案中，癌症包括各种类型的实体瘤，包括癌、肉瘤和淋巴瘤。本文中描述了示例性靶肽抗原。
17、在一些实施方案中，所述患者患有感染性疾病或处于感染性疾病的风险中。例如，经历了hsct的患者因免疫受损状态而处于感染性疾病的特定风险中。可被治疗或预防的感染性疾病包括由细菌、病毒、朊病毒、真菌、寄生虫、蠕虫等引起的感染性疾病。此类疾病包括aids、乙型/丙型肝炎、cmv感染、eb病毒(ebv)感染、流感、疱疹病毒感染(包括带状疱疹)和腺病毒感染。
18、在其他实施方案中，本发明提供了一种用于制备γδt细胞群体的方法。所述方法包括在il-2、il-4、il-6、inf-γ和il-1β中的两者或更多者存在下扩增包含γδt细胞的细胞群体。在扩增之前，所述细胞群体包含少于约20％或少于约10％或少于约8％的γδt细胞。在一些实施方案中，所述细胞群体是cd28富集的。在一些实施方案中，所述细胞群体是cd4+耗减的。如本文所述可进行培养中细胞的扩增，如1-4周。γδt细胞可使用诸如细胞分选的已知方法与其他细胞分离，并且可作为细胞组合物提供用于过继转移或研究用途，并且可替代地可进行修饰以表达一种或多种异源或工程化的基因，如异源或工程化的t细胞受体(例如，αβtcr)，包括嵌合抗原受体(car)。
19、其他方面和实施方案将根据以下具体实施方式而是显而易见的。
1.一种适合用于过继免疫治疗的分离的细胞组合物，所述组合物包含在药学上可接受的载体中的至少106个对一种或多种靶肽抗原具有特异性的cd8+t细胞，其中所述组合物中的cd8+t细胞是至少50％的中枢记忆t细胞和效应记忆t细胞，并且包含t记忆干细胞(tscm)，其中，
2.如权利要求1所述的分离的细胞组合物，其中所述cd8+t细胞对至少3种靶肽抗原、或至少4种靶肽抗原或至少5种靶肽抗原具有特异性。
3.如权利要求1所述的分离的细胞组合物，其中所述组合物中t细胞对靶肽抗原的特异性是通过mhc多聚体染色界定的。
4.如权利要求1所述的分离的细胞组合物，其中所述靶肽抗原是肿瘤相关抗原。
5.如权利要求4所述的分离的细胞组合物，其中所述靶肽抗原是与急性髓性白血病(aml)相关的抗原，并且任选地选自表1。
6.如权利要求5所述的分离的细胞组合物，其中所述靶肽抗原包含wt-1、prame、生存素和细胞周期蛋白a1的肽表位。
7.如权利要求4所述的分离的细胞组合物，其中所述靶肽抗原是与多发性骨髓瘤相关的抗原，并且任选地包括ny-eso-1、wt-1、xbp1-us、xbp1-sp、cd138、cs1和sox2抗原中的一种或多种。
8.如权利要求7所述的分离的细胞组合物，其中一种或多种所述靶肽抗原选自表2。
9.如权利要求1所述的分离的细胞组合物，其中一种或多种靶肽抗原是病毒抗原，并且其中一种或多种所述靶肽抗原选自表2。
10.如权利要求1和9中任一项所述的分离的细胞组合物，其中所述细胞组合物是至少90％的t细胞。
11.如权利要求10所述的分离的细胞组合物，其中至少5％的所述cd8+t细胞对靶肽抗原具有特异性。
12.如权利要求11所述的分离的细胞组合物，其中至少10％的所述cd8+t细胞对靶肽抗原具有特异性。
13.如权利要求11所述的分离的细胞组合物，其中至少15％的所述cd8+t细胞对靶肽抗原具有特异性。
14.如权利要求11所述的分离的细胞组合物，其中至少30％的所述cd8+t细胞对靶肽抗原具有特异性。
15.如权利要求1或14中任一项所述的分离的细胞组合物，其中所述细胞组合物还包含对细菌性、病毒性和/或真菌性病原体具有特异性的cd8+t细胞，任选地其中对细菌性、病毒性或真菌性病原体具有特异性的所述cd8+t细胞包括对流感、cmv、ebv和/或腺病毒的抗原具有特异性的t细胞。
16.如权利要求1至15中任一项所述的分离的细胞组合物，其中所述cd8+t细胞是至少约1％的t记忆干细胞。
17.如权利要求1至16中任一项所述的分离的细胞组合物，其中大于95％的所述cd8+t细胞包含记忆表型。
18.如权利要求17所述的分离的细胞组合物，其中所述cd8+t细胞是至少70％的中枢记忆t细胞和效应记忆t细胞。
19.如权利要求17所述的分离的细胞组合物，其中所述cd8+t细胞是至少80％的中枢记忆t细胞和效应记忆t细胞。
20.如权利要求17所述的分离的细胞组合物，其中所述cd8+t细胞是至少90％的中枢记忆t细胞和效应记忆t细胞。
21.如权利要求17至20中任一项所述的分离的细胞组合物，其中所述对一种或多种靶肽抗原具有特异性的cd8+t细胞是至少50％的中枢记忆t细胞和效应记忆t细胞，或至少80％的中枢记忆t细胞和效应记忆t细胞。
22.如权利要求17至21中任一项所述的分离的细胞组合物，其中所述cd8+t细胞是少于10％终末分化的。
23.如权利要求17至22中任一项所述的分离的细胞组合物，其中所述组合物包含少于5％的初始t细胞(tn)。
24.如权利要求1至23中任一项所述的分离的细胞组合物，其中至少40％的所述cd8+t细胞在激活后表现出多功能性表型。
25.如权利要求1至24中任一项所述的分离的细胞组合物，其中所述组合物还包含γδt细胞。
