本发明属于植物病毒生物检测，具体涉及一种同步检测sosgv、smv、bcmv和cpmmv四种大豆重要病毒的引物及方法。
背景技术：
1、大豆起源于中国，已有五千年栽培历史，是我国重要的粮食和油料作物，也是世界上最重要的豆类作物。大豆含有丰富的植物蛋白质，是植物油和蛋白的重要来源，在世界各地广泛种植。由于国内对于大豆的需求与日俱增，中国的大豆产量难以满足国内日益增多的消费，近87%的大豆依赖进口。近年来，大豆受多种病毒病害危害，严重影响其产量和品质。近年来，在我国黄淮海大豆主产区大面积发生“有荚无粒”症青现象，导致大豆严重减产，重发区甚至绝收。感病大豆在正常成熟时植株仍然持青不能收获，并且豆荚空瘪或者籽粒瘪，造成严重的经济损失。“有荚无粒”症青的连年爆发，导致黄淮海地区农民种植大豆的意愿不断下降，直接影响了我国的大豆安全生产和大豆振兴计划的实施。本课题组团队首次破解了大豆症青病害的致病病原为一种新型重组双生病毒-大豆症青病毒（soybeanyellow dwarf-associated geminivirus，sosgv）。调查发现，此病毒2017-2021年已呈现爆发的趋势，在黄淮海地区大豆上带毒率达到40%以上，严重威胁我国大豆的安全生产。另外，在我国大豆上频繁发生的重要病毒还包括大豆花叶病毒（soybean mosaic virus，smv）、菜豆普通花叶病毒（bean common mosaic virus，bcmv）、豇豆轻斑驳病毒（cowpea mildmottle virus，cpmmv）等。smv属于马铃薯y病毒科（ potyviridae）马铃薯y病毒属（ potyvirus）成员，是大豆生产中最普遍和最具破坏性的病毒，在世界范围内广泛存在和传播。smv 感染大豆后植株出现多种症状表型，主要包括花叶、叶片褪绿，严重时引起叶片皱缩畸形；还会引起不同程度的坏死，包括茎尖坏死和系统性坏死等。smv侵染大豆后危害严重，严重时导致大豆种植减产70%以上。bcmv也是马铃薯y病毒属（ potyvirus）成员，侵染豆科植物后主要表现为叶变皱缩，豆荚斑驳或畸形等症状。近年来bcmv的广泛发生对我国山东、安徽、江苏等地的大豆、菜豆、蚕豆等豆科作物的造成的严重威胁。cpmmv属于乙型线状病毒科（ betaflexiviridae）香石竹潜隐病毒属（ carlavirus）成员，病毒由烟粉虱传播，目前该病毒已在亚洲、非洲、美洲等多个国家和地区发生；2019年cpmmv在我国的豇豆上也发现了该病毒，随后在大豆、蚕豆等豆科作物上相继发生，病毒侵染后主要引起系统性斑点、褪绿以及叶片畸形等症状。cpmmv作为我国豆科作物病毒病害中的新发病毒，其发生与流行对我国大豆、豇豆等豆科作物的种植造成了重要威胁。大豆上不仅单个病毒侵染，同时多种病毒复合侵染也广泛发生。因此，针对当前威胁大豆生产上的多种重要病毒，研发快速、高效的多种病毒同步检测技术，对于大豆病毒病早期监测预警和制定有效的防控措施具有重要意义。
2、植物病毒的检测包括生物学检测、电镜检测技术、血清学检测和核酸技术，rt-pcr/pcr技术是植物病毒核酸检测的主要方法，其检测灵敏度高，检测用时短，且准确度高。但常规的rt-pcr/pcr技术每次只能检测一种病毒，对于多种病毒复合侵染的情况检测耗费时间长，且对同一样品的多次检测过程操作繁琐，增加检测成本，同时增加样品的交叉污染。为此，本方案基于rt-pcr技术研发了同步检测sosgv、smv、bcmv、cpmmv 4种重要大豆病毒病原种类的技术，建立的同步检测技术可在1个半小时之内同时对来自同一样品或不同样品中（混合样）中可能携带的sosgv、smv、bcmv和cpmmv 四种大豆病毒进行检测，同时显著减少了检测频次，并降低了检测成本。建立的技术对于高效、准确地鉴定田间大豆病毒病害的病毒种类，提高常发性、新发性、突发性大豆病毒病害的精准预测预报能力，有针对性地开展病毒病害防治措施具有重要意义。
技术实现思路
1、解决的技术问题：针对上述技术问题，本发明提供一种同步检测sosgv、smv、bcmv和cpmmv四种大豆重要病毒的引物及方法，建立的同步检测方法可在1.5小时内同时对来自同一样品或不同样品（混合样）中可能携带的sosgv、smv、bcmv和cpmmv 四种大豆病毒进行检测，显著减少了检测频次，进而降低了检测成本；本发明方法可以高效、准确地鉴定田间大豆病毒病害的病毒种类，提高常发性、新发性和突发性大豆病毒病害的精准预测预报能力，对于有针对性地开展病毒病害防治措施具有重要意义。
2、技术方案：第一方面，本发明提供同步检测sosgv、smv、bcmv和cpmmv四种大豆重要病毒的引物，所述引物包括用于扩增cpmmv的引物对、用于扩增bcmv的引物对、用于扩增smv的引物对和用于扩增sosgv的引物对：
3、sosgv的上游引物sosgv-f的核苷酸序列如seq id no.1所示，
4、sosgv的下游引物sosgv-r的核苷酸序列如seq id no.2所示；
5、smv的上游引物smv-f的核苷酸序列如seq id no.3所示，
6、smv的下游引物smv-r的核苷酸序列如seq id no.4所示；
7、bcmv的上游引物bcmv-f的核苷酸序列如seq id no.5所示，
8、bcmv的下游引物bcmv-r的核苷酸序列如seq id no.6所示；
9、cpmmv的上游引物cpmmv-f的核苷酸序列如seq id no.7所示，
10、cpmmv的下游引物cpmmv-r的核苷酸序列如seq id no.8所示；具体如下表1所示：
11、表1 同步检测sosgv、smv、bcmv和cpmmv四种大豆重要病毒的引物信息
12、
13、第二方面，本发明提供一种同步检测sosgv、smv、bcmv和cpmmv四种大豆重要病毒的试剂盒，包括第一方面所述的引物。
14、第三方面，本发明提供一种基于rt-pcr技术同步检测sosgv、smv、bcmv和cpmmv四种大豆重要病毒的方法，包括以下步骤：
15、s1、提取样品总核酸；
16、s2、以步骤s1提取的样品总核酸为模板，对其中的rna进行反转录获得cdna；
17、s3、以步骤s2得到的cdna为模板，采用第一方面所述的引物进行pcr扩增，得到扩增产物；
18、s4、琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，若在274bp处存在目的片段，则表明样品中具有sosgv病毒；若在576bp处存在目的片段，则表明样品中具有smv病毒；若在887bp处存在目的片段，则表明样品中具有bcmv病毒；若在1260bp处存在目的片段，则表明样品中具有cpmmv病毒。
19、优选的，步骤s1中提取样品总核酸的方法为ctab法。
20、优选的，步骤s2中反转录的体系和条件为：10 mm dntp 1 µl、随机引物 1 µl、样品总核酸 2 µg，用rnase free ddh2o补足至14.5 µl，混合均匀后，置于70 ℃，反应 5min；置于冰上冷却，加入m-mlv rt 5×buffer 4 µl、recombinant rnase inhibitor（rri）0.5 µl和m-mlv 1 µl，总体积 20 µl；将混匀后的体系放入 pcr 仪中，42℃反应 60 min，再 72℃ 反应 15 min，-20℃保存。
21、优选的，步骤s3中pcr扩增体系为：10×pcr buffer 2 µl，10 mm dntp 0.4 µl，10µm sosgv-f/sosgv-r各0.2 µl，10 µm smv-f/smv-r各0.2 µl，10 µm bcmv-f/bcmv-r各0.2µl，10 µm cpmmv-f/cpmmv-r各0.4 µl，，taq plus dna polymerase 0.2 µl，ddh2o 15.4 µl；反应条件：94℃ 2 min，94℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 1 min，扩增35个循环，72℃延伸10min后4℃保存。
22、优选的，步骤s4中琼脂糖凝胶电泳的条件为1.2％的琼脂糖凝胶、在0.5×tbe缓冲液环境中，150 v稳压电泳15 min。
23、第四方面，本发明提供第一方面所述的引物或第二方面所述的试剂盒或第三方面所述的方法在检测生物样品是否含有sosgv、smv、bcmv和cpmmv 四种病毒中的应用。
24、有益效果：1）本发明通过选择sosgv、smv、bcmv和cpmmv基因组序列的保守区段并回避4种病毒基因组中核苷酸相似度较高部分，设计的sosgv、smv、bcmv和cpmmv的检测引物组具有良好的检测效果和检测特异性。结合rt-pcr/pcr同步检测技术引物要求，设计的sosgv、smv、bcmv和cpmmv目标扩增片段分别为274 bp、576 bp、887 bp和1260 bp，在琼脂糖凝胶电泳后目标条带易于区分，且涉及的4种病毒特异性检测引物具有相近的退火温度，保证其能在一个反应体系内工作；
25、2）本发明基于rt-pcr/pcr 扩增技术建立了sosgv、smv、bcmv和cpmmv 共4种重要大豆病毒的同步快速检测方法，大大节省了上述4种大豆病毒病毒病害种类的检测时间（总的检测时间可缩短至1.5小时），同时显著减少了检测频次，降低了检测成本，提高了田间大豆病毒病害快速诊断的水平；
26、3）本发明建立的基于rt-pcr/pcr技术检测4种重要大豆病毒的检测方法具有良好的检测特异性，最低有效检测浓度（即最低总核酸浓度）为0.065 ng/µl；
27、4）建立的同步快速检测技术利用提取的样品总核酸为模板，实现了dna病毒和rna病毒的同步检测。
1.同步检测sosgv、smv、bcmv和cpmmv四种大豆重要病毒的引物，其特征在于，所述引物包括用于扩增sosgv的引物对、用于扩增smv的引物对、用于扩增bcmv的引物对和用于扩增cpmmv的引物对：
2.一种同步检测sosgv、smv、bcmv和cpmmv四种大豆重要病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物。
3.一种基于rt-pcr技术同步检测sosgv、smv、bcmv和cpmmv四种大豆重要病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤s1中提取样品总核酸的方法为ctab法。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤s2中反转录的体系和条件为：10 mmdntp 1 µl、随机引物 1 µl、样品总核酸 2 µg，用rnase free ddh2o补足至14.5 µl，混合均匀后，置于70 ℃，反应 5 min；置于冰上冷却，加入m-mlv rt 5×buffer 4 µl、recombinant rnase inhibitor（rri） 0.5 µl和m-mlv 1 µl，总体积 20 µl；将混匀后的体系放入 pcr 仪中，42℃反应 60 min，再 72℃ 反应 15 min，-20℃保存。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤s3中pcr扩增体系为：10×pcr buffer2 µl，10 mm dntp 0.4 µl，10 µm sosgv-f/sosgv-r各0.2 µl，10 µm smv-f/smv-r各0.2 µl，10 µm bcmv-f/bcmv-r各0.2 µl，10 µm cpmmv-f/cpmmv-r各0.4 µl，taq plus dnapolymerase 0.2 µl，ddh2o 15.4 µl；反应条件：94℃ 2 min，94℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃1 min，扩增35个循环，72℃延伸10 min后4℃保存。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤s4中琼脂糖凝胶电泳的条件为1.2％的琼脂糖凝胶、在0.5×tbe缓冲液环境中，150 v稳压电泳15 min。
8.权利要求1所述的引物或权利要求2所述的试剂盒或权利要求3-7任一项所述的方法在检测生物样品是否含有sosgv、smv、bcmv和cpmmv 四种病毒中的应用。
