本发明涉及凝胶栓塞微球及其制备方法，特别涉及一种具有优异力学性能，形态稳定，可大量负载凝血酶等药物并实现缓释的凝胶栓塞微球及其制备方法。
背景技术：
1、肥厚型心肌病是导致心脏性猝死的主要原因之一。对于药物控制不佳的患者，经皮室间隔心肌化学消融术（asa）已逐渐成为一种替代外科手术的治疗方式。但目前所使用的无水酒精消融剂推注入靶血管后无可控性，常发生溢漏或流入其它冠脉，导致非靶消融部位心肌梗死或传导系统损伤等严重后果，因此无水酒精并非一种理想的asa消融剂。
2、近年来，非酒精室间隔消融已为肥厚型梗阻性心肌病（hocm）介入治疗领域的研究热点，而彻底栓塞成为治疗成功的保障。目前已有采用微弹簧圈、明胶海绵或多聚物颗粒、氰基丙烯酸盐粘合剂等介质进行物理或化学消融的单中心、小样本量研究报道，结论普遍认为具有较好的围术期安全性，但上述介质是否能达到酒精消融相同的有效性尚需进一步验证。近年来，采用栓塞微球消融剂或栓塞剂来实现介入治疗也成为非常热门的治疗手段。如何配合药物和器械来实现彻底的栓塞成为此类器械性能的关键。凝血酶可有效固化血液提升栓塞效果，但凝血酶本身不稳定，遇到酸、碱、重金属或高温时极易失活，无法单独使用，如可实现特殊的微球可有效负载，将有效发挥两者的共同作用。
3、在凝胶栓塞微球领域，大量的研究集中在血管栓塞领域，各类pva、海藻酸钠微球被开发并应用，已出现少量产品，如迈瑞微球系列。但微球的靶向载药性和缓释性依然是一个需要攻克的难关，尤其是还需在摘要的同时具有良好的力学特性和生物相容性，对材料本身的设计提出了更高的要求。
4、本发明针对以上问题，本发明开发了新型的凝胶栓塞微球，既可满足基本力学性能要求，在栓塞过程中不发力学性能变化，还可大量负载凝血酶并实现缓释，将极大提高hocm的治疗效果。
技术实现思路
1、本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提供一种凝胶微球，具有良好力学性能，形态稳定，且可大量负载凝血酶并实现稳定的长效缓释，以保证良好的栓塞效果。
2、该微球是由以下技术实现的：
3、一种可负载凝血酶高强度栓塞凝胶微球，其主体由以下几种主要物质及相应质量关系构成：
4、聚丙烯酰胺-聚丙烯酸共聚物 100
5、两性离子聚合物 20-50
6、环肽功能化壳聚糖 3-8
7、进一步，所述聚丙烯酰胺-聚丙烯酸共聚物（paam- paac）中，丙烯酰胺（aam）和丙烯酸（aac）链段的摩尔比介于0.6：1-1：2之间，paam- paac由交联剂n’n-亚甲基双丙烯酰胺（bis）在凝胶内由实现交联，交联剂的摩尔量介于aam和aac单体量之和的2-4%之间，纯聚合物的zeta电位介于-30mv到-65mv之间。
8、进一步，所述两性离子聚合物为聚甲基丙烯酸磺基甜菜碱、聚甲基丙烯酰乙基磺基甜菜碱、聚甲基丙烯酸羧基甜菜碱，聚丙烯酸甲酯半胱氨酸、聚丙烯酸甲酯丝氨酸中的一种，其分子量介于mw=50-100 kda之间。
9、所述聚丙烯酸甲酯半胱氨酸的分子结构如下：
10、
11、所述聚丙烯酸甲酯丝氨酸的分子结构如下：
12、
13、进一步，所述环肽功能化壳聚糖为将环肽接入壳聚糖大分子链中进行修饰，所示环肽可为多元环肽及其衍生物，优选的，多元环肽为五元环肽。
14、进一步，所述环肽的质量介于壳聚糖质量的20-40%之间；环肽功能化壳聚糖的分子量介于mw=50-120 kda之间。
15、进一步，所述五元环肽，由精氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、d型苯丙氨酸、赖氨酸组成，并且首尾酰胺键成环其分子结构如下：
16、
17、进一步，所述多元环肽衍生物可为环肽-聚乙二醇-叶酸、环肽-聚乙二醇-氨基中的一种。
18、进一步，所述五元环肽修饰壳聚糖基大分子可直接购买市售商品，也可壳聚糖中胺基的反应如缩合、席夫碱反应、改性后的硫代反应等实现接入，还可通过发明专利201811542507.4表述的方法根据实际比例和需求进行改良后合成，具体如下：
19、取氨基聚乙二醇2000，溶于少量无水二甲亚砜，按氨基聚乙二醇2000：二琥珀酰亚胺的摩尔比为1：2，取二琥珀酰亚胺，溶于适量无水二甲亚砜，将二琥珀酰亚胺的二甲亚砜溶液缓慢滴加至聚乙二醇2000的二甲亚砜溶液中，室温搅拌2～9小时，得反应液1，按聚乙二醇2000：环肽的摩尔比为1：1，取环肽溶于适量无水二甲亚砜，制备浓度为5.0mg/ml的溶液，将环肽的无水二甲亚砜溶液，缓慢滴加至反应液1，室温搅拌1～12小时，得反应液2，按壳聚糖上游离氨基：环肽的摩尔比为3：1～20：1取壳聚糖，将反应液2缓慢滴加至壳聚糖弱酸水溶液中，室温搅拌1～24小时，将终反应液置于截留分子量为4000的透析袋中，蒸馏水透析48小时，冷冻干燥，得到环肽-壳聚糖改性物。
20、进一步，所述凝胶中所有分子链所带阳离子基团和阴离子基团的离子摩尔比介于1.2-2.5之间；阴离子的增加有利于凝胶的溶胀，并为药物负载凝血酶提供极性点。
21、进一步，所述凝胶孔尺寸受物质比例，聚合物组成和内部电荷比影响，孔径介于50-500μm之间。
22、进一步，所述凝胶的制备方式包括反相乳液法和微流控法。
23、进一步，所述反相乳液法的制备工艺为：
24、i：将单体丙烯酰胺、丙烯酸、交联剂n’n-亚甲基双丙烯酰胺和光引发剂溶解于水中形成均匀溶液a，光引发剂的用量介于单体质量的0.2%-0.5%之间，溶剂的质量浓度介于10%-20%之间；
25、ii：在溶液a中加入两性离子聚合物和环肽功能化壳聚糖溶液，搅拌均匀后形成水相预聚液；环肽功能化壳聚糖溶液的质量浓度介于10-20%之间，溶液为dmso和水的混合液，两者的体积比介于1：3-1：6之间；
26、iii：将水相预聚液投入体积为其3-5倍的油相液中，200-600rmp搅拌使得水相预聚液在油相中形成50-800um的微球球体，加入碱液将体系的ph值至9.5-10.5之间；
27、其中，油相液由低粘度油类和表面活性剂构成，表面活性剂的质量浓度介于油类的0.5-1.5%之间；
28、iv：采用一定波长紫外光照射iii中的微球悬浮体系，持续搅拌并照射2-4小时，得到凝胶微球；
29、v：将凝胶微球以纯水持续浸渍纯化，去除微球中的dmso溶剂并调节ph值至中性，得到最终微球产物。
30、进一步，所述微流控的制备工艺为：
31、a: 将单体丙烯酰胺、丙烯酸、交联剂n’n-亚甲基双丙烯酰胺，两性离子聚合物、环肽功能化壳聚糖、光引发剂溶解于dmso和水的混合液中，得到水相预聚液，dmso和水的体积比介于1：5-1：10之间；
32、b：以含有表面活性剂的低粘度油类为油相；表面活性剂在油相中的浓度介于20-40g/l之间；
33、c: 将水相预聚液和油相分别通入微流控芯片中，控制油相的流速为20-80μl/min，水相流速为2-8μl/min；
34、d: 以ph介于9.5-10.5的碱性液体为接收液，将流出微球导入接收液中后并以150-300rmp转速持续搅拌2-4小时，以一定波长紫外光照射持续照射，得到凝胶微球；
35、e: 将凝胶微球以纯水持续浸渍纯化，去除微球中的dmso溶剂并调节ph值至中性，得到最终微球产物。
36、进一步，所述低粘度油类的粘度介于100-1000cp之间, 包括十六烷烃、液体石蜡、矿物油、棕榈酸异丙酯、甲基硅油、甲基苯基硅油ar-20中的一种；所述表面活性剂包括span80、聚甘油蓖麻醇酸酯pgpr、吐温20、十二烷基硫酸钠sds、十六烷基三甲基溴化铵ctab中的一种，hlb值介于12-42之间。
37、进一步，优选的，低粘度油类选择甲基苯基硅油ar-20和液体石蜡；表面活性剂选择span 80和十六烷基三甲基溴化铵ctab。
38、进一步，所述多肽修饰壳聚糖溶液可根据大分子特性采用水溶液、水/dmso混合溶液或dmso溶液，如采用加入dmso溶液，则凝胶成型后需反复浸渍洗涤以脱除dmso。
39、进一步，所述光引发剂为光引发剂i2959、光引发剂1173中的一种，对应的紫外照射波长为365nm和320nm。
40、进一步，所述微球在制备过程中可在水相预聚液中负载凝血酶，负载浓度可达50mg/ml，可实现6-12天的缓释。
41、进一步，所述凝血酶有多种类型和分子量；优选的，本发明中凝血酶为小分子凝血酶，为市销产品，其cas：9002-04-4，其分子结构如下：
42、
43、进一步，所述微球可实现以上良好的力学性能，合适的弹性以及较高的凝血酶负载效率，是由于其特殊的分子结构包括凝胶孔结构，其中非交联大分子的链长度，分子中各电荷的比例以及其中的多肽基团赋予的。其中，合适的聚合物交联密度和分子量可对凝胶孔尺寸进行调节，适当的非结合电荷有利于调控凝胶的溶胀性控制，适当的非交联大分子，在本罚命中包含的两性离子聚合物、多肽修饰壳聚糖以孤立链存在，可贯通若干孔结构，可有效的实现凝胶的增强和模量的提升；同时，凝胶网络中过量的阳离子基团可有利于其与具有负电荷基团凝血酶之间的结合，壳聚糖改性引入的多肽基团也起到进一步增加其与凝血酶的结合性的作用，还可提供一定与血管壁之间的结合性。
44、进一步，所述微球的平衡溶胀率以凝胶干球质量为基础介于220%-360%之间。
45、进一步，所述可制备粒径可介于50-800μm之间，按粒径进行分筛后可设定不同型号尺寸，可以100μm为限。
46、进一步，所述微球可承受压缩形变介于40-75%之间，所能承受的最大压强为20-40kpa，超过极限微球则无法回复形态且容易破碎，在压缩极限范围内微球可以回复形态。
47、进一步，所述微球的性能测试方法包括：
48、微球的压缩比例采用水凝胶微球平行板压缩试验机测试压缩形变率和受力。
49、微球对凝血酶的负载浓度加入量进行计算，释放浓度采用紫外光谱测试测试，以280nm附近峰值为特征峰，测试释放后溶液中的酶浓度。
1.一种可负载凝血酶高强度栓塞凝胶微球，其主体由以下几种主要物质及相应质量关系构成：
2.如权利要求1所述的一种可负载凝血酶高强度栓塞凝胶微球，其特征在于，所述聚丙烯酰胺-聚丙烯酸共聚物中，丙烯酰胺和丙烯酸链段的摩尔比介于0.6：1-1：2之间，聚丙烯酰胺-聚丙烯酸共聚物在凝胶内由交联剂n’n-亚甲基双丙烯酰胺实现交联，交联剂的摩尔量介于丙烯酰胺和丙烯酸单体量之和的2-4%之间，纯聚丙烯酰胺-聚丙烯酸共聚物的zeta电位介于-30mv到-65mv之间。
3.如权利要求1所述的一种可负载凝血酶高强度栓塞凝胶微球，其特征在于，两性离子聚合物为聚甲基丙烯酸磺基甜菜碱、聚甲基丙烯酰乙基磺基甜菜碱、聚甲基丙烯酸羧基甜菜碱、聚丙烯酸甲酯半胱氨酸、聚丙烯酸甲酯丝氨酸中的一种，其分子量介于mw=50-100kda之间。
4.如权利要求1所述的一种可负载凝血酶高强度栓塞凝胶微球，其特征在于，所述环肽功能化壳聚糖为将环肽接入壳聚糖大分子链中进行修饰，所示环肽可为多元环肽及其衍生物，优选的，多元环肽为五元环肽。
5.如权利要求1所述的一种可负载凝血酶高强度栓塞凝胶微球，其特征在于，所述凝胶中所有分子链所带阳离子基团和阴离子基团的离子摩尔比介于1.2-2.5之间。
6.如权利要求1所述的一种可负载凝血酶高强度栓塞凝胶微球，其特征在于，所述凝胶的制备方式包括反相乳液法和微流控法。
7.如权利要求1所述的一种可负载凝血酶高强度栓塞凝胶微球，其特征在于，所述反相乳液法的制备工艺为：
8.如权利要求1所述的一种具有凝血功能的高强度栓塞凝胶微球，其特征在于，所述微流控的制备工艺为：
9.如权利要求7，8所述的一种具有凝血功能的高强度栓塞凝胶微球，其特征在于，所述低粘度油类的粘度介于100-1000cp之间, 包括十六烷烃、液体石蜡、矿物油、棕榈酸异丙酯、甲基硅油、甲基苯基硅油ar-20中的一种；所述表面活性剂包括span 80、聚甘油蓖麻醇酸酯pgpr、吐温20、十二烷基硫酸钠sds、十六烷基三甲基溴化铵ctab中的一种，hlb值介于16-42之间。
10.如权利要求7，8所述的一种具有凝血功能的高强度栓塞凝胶微球，其特征在于，所述微球在制备过程中可在水相预聚液中负载凝血酶，负载浓度可达50mg/ml，可实现6-12天的缓释。
