本发明涉及能够以高亲和力识别衍生自wt1抗原短肽的tcr。本发明还涉及转导上述tcr获得的wt1特异性的t细胞，以及它们在预防和治疗与wt1相关肿瘤中的应用。
背景技术：
1、t细胞免疫疗法是肿瘤免疫治疗中一种十分重要的方法。通过从肿瘤组织中分离出肿瘤浸润性淋巴细胞(til)，经过体外克隆和扩增后再回输给病人，能够对放疗、化疗产生耐受的晚期癌症病人获得持久缓解，产生良好的临床治疗效果(zacharakis,n.etal.nat med.2018,24(6):724-730.)。但由于til的分离和培养不仅条件苛刻，为达到临床治疗的细胞数所需的时间长，更主要的是到目前为止，能够成功地分离出til的肿瘤组织还非常有限，从而使得til在肿瘤临床中的应用受到了限制。
2、t细胞识别肿瘤主要是通过其表面上的t细胞受体(t cell receptor，tcr)来实现。tcr具有识别肿瘤细胞上人类主要组织相容性复合体(mhc)-抗原肽复合物的能力。tcr由α、β两条肽链形成异二聚体结构。每条肽链各包含可变区、连接区和恒定区，β链通常还在可变区和连接区之间含有短的多变区，但该多变区常被视作连接区的一部分。各可变区包含嵌合在框架结构(framework regions)中的3个cdr(互补决定区)，即cdr1、cdr2和cdr3。cdr区决定了tcr与mhc复合物的结合，其中cdr3由可变区和连接区重组而成，被称为超变区，它直接决定了tcr的抗原特异性。在tcr识别mhc-抗原肽复合物时，cdr3可直接与抗原肽结合。cdr1和cdr2主要与mhc分子结合槽的两个α螺旋接触。这些相互作用确保tcr准确识别mhc-抗原肽复合物。tcr的α和β链一般看作各有两个“结构域”，即可变区和恒定区，其中可变区中包含连接区。tcr恒定区的序列可以在国际免疫遗传学信息系统(imgt)的公开数据库中找到，如tcr分子α链的恒定区序列为“trac”，tcr分子β链的恒定区序列为“trbc1”或“trbc2”。此外，tcr的α和β链还包含一个跨膜区和一个短的胞质区。
3、利用基因转导的方法将能够识别肿瘤细胞的tcr转入病人的免疫t细胞中去，就可以将病人的t细胞改造为对肿瘤有特异性的细胞毒性t细胞(tcr-t)。当将此种基因工程改造的tcr-t输送到病人体内时，这些对肿瘤有特异性的tcr-t在遇到肿瘤细胞上的mhc-肽复合物时，就会通过识别而被激活，从而在病人体内扩增，并通过杀伤肿瘤细胞而达到治疗肿瘤的效果。
4、wt1属于肿瘤相关性抗原(tumor associated antigen，taa)。wt1是一个胚胎发育过程中的转录因子。在成年人中，wt1在肾足细胞、睾丸、卵巢、乳腺肌上皮细胞和部分来自骨髓的cd34+干细胞中都有一定的表达，但是wt1在正常组织中的表达程度很有限(yangl.et al.，leukemia，2007，21(5)：868-876)。而在大多数白血病中，wt1则明显过度表达(yong as.et al.，leukemia，2008，22(9)：1721-1727)。尤其是在aml和cml的cd34+的干细胞中明显过度表达(saito y.et al.，sci transl med，2010，2(17)：17ra9；gerber jm.etal.，am j hematol，2011；86(1)：31-37)。由于wt1的表达水平与预后结果呈负相关，所以目前临床上采用wt1作为标志物来监测白血病人的残留疾病(cilloni d&saglio g.actahaematol，2004，112(1-2)：79-84；schroeder t.et al.，blood，2014，124(21)：4661-4662)，并预测白血病的复发(aude g.chapuis.et al.,nat med,2019,25(7)：1064-1072)。除了在多种白血病中过度表达外，wt1还在多种实体瘤中也过度表达(nakatsuka s.etal.，mod pathol，2006，19(6)：804-814；；keiko naitoh.et al.，anticancer res,2016,36(7):3715-3724.)。所以有研究指出wt1是肿瘤免疫治疗的优良靶抗原(cheever ma.etal.，clin cancer res，2009，15(17)：5323-5337；haruo sugiyama,jpn j clin oncol,2010,40(5):377-387)。wt1在细胞内生成后被降解成小分子多肽，在与mhc分子结合形成复合物后，被呈递到细胞表面。rmfpnapyl是衍生自wt1抗原的短肽，是治疗wt1相关肿瘤的一个靶标。对于上述这些与wt1相关的恶性肿瘤，传统的疗法是采用放疗和化疗等方法，但都会对病人的正常细胞造成损害。最新的研究表明，利用能够识别rmfpnapyl抗原肽的tcr-t来对肿瘤进行免疫基因治疗时，它不仅可以克服传统放疗、化疗的无特异性以及相应的毒副作用，而且通过给病人输入能够识别rmfpnapyl抗原肽的wt1-tcr-t时，可以使100％的肿瘤病人不再复发(chapuis.et al.，nat medicine，2019，25(7)：1064-1072)，这无疑是一个十分喜人的研究成果。该文献报道的tcr是从人白细胞抗原hla-a2阳性供者的t细胞中分离而来，那么根据免疫学原理，它应该不是一个高亲和力的tcr。这是因为wt1是一个自身抗原，所以为了避免自身免疫疾病，hla-a2阳性供者体内对wt1具有高亲和力的细胞毒性t淋巴细胞(ctl)早在胸腺细胞的阴性选择过程中就被删除掉了。这样一来，在供者体内自身的t细胞中，往往只有对wt1这一自身抗原产生耐受而且亲和力较低的wt1-ctl才能存活下来。由于低亲和力的ctl往往具有较差的抗肿瘤活性(derby.et al.,j.immunol.2001，166：1690-1697)，因此以t细胞为基础的肿瘤免疫治疗的一个非常重要的目标就是要能够获取对肿瘤抗原具有高亲和力和特异性的ctl(zeh.et al.,j.immunol.1999，162:989-994)。
5、美国专利us8697854b2描述了一种非自我限制性或者叫异体限制性ctl的方案来获取高亲和力的ctl。通过采用异体限制性ctl的方案，他们获得了对肿瘤相关性抗原酪氨酸酶有特异性的ctl与高亲和力的tcr。该技术的原理是基于采用自身的mhc-肽复合物来刺激异体的ctl，由于来自异体的ctl并未经过自身mhc的阴性选择过程，因而它们含有对自身mhc高度敏感的ctl与高亲和力的tcr。但该方案也有一个明显的缺点就是在对自身的mhc-肽复合物产生免疫应答的t细胞中，只有一小部分是既受mhc的限制，又对抗原肽有特异性，而往往大部分的细胞是只识别了mhc，而不具备对抗原肽的特异性。也就是说用此方法刺激出来的ctl，其中大多数是非特异性的t细胞。如果用这样的ctl来治疗肿瘤，则它们会引起严重的非特异性免疫反应。
6、因此，仍然需要寻找其他对肿瘤抗原wt1既有高亲和力又具特异性的ctl，进而分离并获取对肿瘤抗原具有高亲和力和特异性的tcr。
技术实现思路
1、为了获得既受mhc的限制，又对抗原肽有特异性的那一小部分有益的ctl，我们对在刺激过程中产生免疫应答的混合t细胞进行单细胞克隆。由于培养t细胞本身就是一个十分困难的实验，如果要把它们分放在每孔中只有一个t细胞的环境中，则就更是难上加难了，因为一个t细胞是很难生存的，所以要想让它生存下来并得到扩增，则整个实验的难度将大大增加，或者说实验成功的可能性也就大大降低了。经过多次的重复实验与大量的筛选工作，我们获得了一株对wt1具有高亲和力与特异性的细胞毒性ctl，并进一步分离而获得了其对wt1具有高亲和力与特异性的tcr。
2、第一方面，本发明提供了一种t细胞受体(tcr)，所述t细胞受体能够以高亲和力识别rmfpnapyl-hla-a*02:01复合物，所述的tcr包含tcrα链可变区和tcrβ链可变区；其中，所述tcrα链可变区包含三个互补决定区(cdr)，其序列为seq id no：2-4、42-44、78-80、114-116或150-152中的任意一种；所述tcrβ链可变区包含三个互补决定区(cdr)，其序列为seqid no：5-7、45-47、81-83、117-119或153-157中的任意一种。
3、优选的，所述tcr为αβ异二聚体，其还包含tcrα链恒定区(trac)和tcrβ链恒定区(trbc1和/或trbc2)；优选地，所述tcr的α链氨基酸序列为seq id no：10、50、86、122或158中列出的任意一种氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；所述tcr的β链氨基酸序列为seq id no：14、54、90、126或162中列出的任意一种氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
4、优选的，所述tcr为单链；优选地，所述tcr的α链可变区氨基酸序列为seq id no：26、66、102、138或174的任意一种，所述tcr的β链可变区氨基酸序列为seq id no：28、68、104、140或176的任意一种；更优选地，所述tcr是由α链可变区与β链可变区通过连接肽链seq id no：32连接而成，所述tcr的氨基酸序列为seq id no：30、70、106、142或178的任意一种。
5、优选的，所述tcr为信使核糖核苷酸(mrna)；优选地，所述tcr-mrna的α链氨基酸序列为seq id no：34、72、108、144或180的任意一种，所述tcr-mrna的β链氨基酸序列为seqid no：36、74、110、146或182的任意一种；更优选地，所述tcr-mrna是由α链与β链通过连接肽链seq id no：40连接而成，所述tcr-mrna的氨基酸序列为seq id no：38、76、112、148或184的任意一种。
6、第二方面，本发明提供的任一项tcr，其是分离或纯化的或是重组的，其是人造的，其是单克隆的，其中所述抗原特异性至少部分地是cd8非依赖性的。
7、第三方面，本发明提供了一种多价tcr复合物，包含至少三个tcr分子，并且其中的至少一个tcr分子为第一、二方面所述的tcr。
8、第四方面，本发明提供了一种核酸分子，所述核酸分子包含编码第一、二方面所述的tcr的核苷酸序列或其互补序列，或第一、二方面所述的tcr的氨基酸序列对应的密码子优化的核苷酸序列；优选地，所述的核酸分子包含编码tcrα链可变区的核苷酸序列seq idno：9、27、49、67、85、103、121、139、157或175的任意一种，或与其具有至少90％序列同一性的序列；所述的核酸分子包含编码tcrβ链可变区的核苷酸序列seq id no：13、29、53、69、89、105、125、141、161或177的任意一种，或与其具有至少90％序列同一性的序列；优选地，所述的核酸分子包含编码tcrα链的核苷酸序列seq id no：11、51、87、123或159的任意一种，或与其具有至少90％序列同一性的序列，所述的核酸分子包含编码tcrβ链的核苷酸序列seq id no：15、55、91、127或163的任意一种，或与其具有至少90％序列同一性的序列；优选地，所述的核酸分子包含编码tcrα链的信使核糖核苷酸序列seq idno：35、73、109、145或181的任意一种，或与其具有至少90％序列同一性的序列，所述的核酸分子包含编码tcrβ链的信使核糖核苷酸序列seq id no：37、75、111、147或183的任意一种，或与其具有至少90％序列同一性的序列，其中所述的信使核糖核苷酸序列经过pseudo-utp(ψ)替换和/或5-methyl-ctp替换。
9、第五方面，本发明提供了一种载体，所述的载体含有第四方面所述的核酸分子；优选地，所述的载体为病毒载体和/或脂质纳米颗粒载体；优选地，所述的载体为慢病毒载体和/或逆转录病毒载体；更优选地，所述的载体为慢病毒载体。
10、第六方面，本发明提供了一种分离的宿主细胞，所述的宿主细胞中含有第五方面所述的载体或染色体中整合有外源的第四方面所述的核酸分子。
11、第七方面，本发明提供了一种细胞，所述细胞为被第四方面所述的核酸分子或第五方面所述载体转导和转染的细胞，其中所述tcr对所述细胞的异源的；优选地，所述细胞为t细胞或干细胞；更优选地，所述细胞为来自受试者的原代t细胞或干细胞。
12、第八方面，本发明提供了一种药物组合物，述组合物含有第一、二方面所述的tcr、第三方面所述的tcr复合物、第四方面所述的核酸分子、或第七方面所述的细胞，以及可药用的载体。
13、第九方面，本发明提供了第一、二方面所述的t细胞受体、或第三方面所述的tcr复合物或第七方面所述的细胞用于制备治疗肿瘤或其他免疫性疾病的药物的用途。
14、应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。
15、下面结合附图和实施例对本发明做详细说明。
1.一种t细胞受体(tcr)，其特征在于：所述t细胞受体能够以高亲和力识别rmfpnapyl-hla-a*02:01复合物，所述的tcr包含tcrα链可变区和tcrβ链可变区，其中：
2.权利要求1所述的t细胞受体(tcr)，其特征在于：所述tcr为αβ异二聚体，其还包含tcrα链恒定区(trac)和tcrβ链恒定区(trbc1和/或trbc2)；
3.权利要求1所述的所述的t细胞受体(tcr)，其特征在于：所述tcr为单链；
4.权利要求1所述的所述的t细胞受体(tcr)，其特征在于：所述tcr为信使核糖核苷酸(mrna)；
5.一种多价t细胞受体(tcr)的复合物，其特征在于，包含至少三个tcr分子，并且其中的至少一个tcr分子为权利要求1-4中任一项所述的tcr。
6.一种核酸分子，其特征在于：所述核酸分子包含编码权利要求1-4中任一项所述的tcr的核苷酸序列或其互补序列，或权利要求1-4中任一项所述的tcr的氨基酸序列对应的密码子优化的核苷酸序列；
7.一种载体，其特征在于：所述的载体含有权利要求6中所述的核酸分子；优选地，所述的载体为病毒载体和/或脂质纳米颗粒载体；优选地，所述的载体为慢病毒载体和/或逆转录病毒载体；更优选地，所述的载体为慢病毒载体。
8.一种分离的宿主细胞，其特征在于：所述的宿主细胞中含有权利要求11中所述的载体或染色体中整合有外源的权利要求6中所述的核酸分子。
9.一种细胞，其特征在于：所述细胞为被权利要求6中所述的核酸分子或权利要求11中所述载体转导和转染的细胞，其中所述tcr对所述细胞的异源的；优选地，所述细胞为t细胞或干细胞；更优选地，所述细胞为来自受试者的原代t细胞或干细胞。
10.一种药物组合物，其特征在于：所述组合物含有权利要求1-4中任一项所述的tcr、权利要求9中所述的tcr复合物、权利要求6中所述的核酸分子、或权利要求9中所述的细胞，以及可药用的载体。
11.权利要求1-4中任一项所述的t细胞受体、或权利要求5中所述的tcr复合物或权利要求9中所述的细胞，用于制备治疗肿瘤或其他免疫性疾病的药物的用途。
