本发明涉及微生物，具体为一种具有耐酸、抗氧化和强黏附的益生菌单细胞的封装方法及封装所得的益生菌。
背景技术：
1、益生菌是一类对人体健康有益的活性微生物，具有调节机体代谢、增强免疫力等生理特性。研究发现，益生菌可以通过微生物组-肠-脑轴、微生物组-肠-肺轴和微生物组-肠-肝轴调节其他器官的功能。2020年，中国食品科学技术学会在《益生菌的科学共识(2020年版)》一文中明确了益生菌的3个核心特征——足够数量、活菌状态及有益健康功能。为了保证益生菌可以带来促进健康的效果，益生菌的推荐摄入量主要在107-1011cfu/d。在保证益生菌的数量的基础上，还应让益生菌能有效地附着在肠道上皮上，以获得持续的肠道定植。近年来，随着我国对益生菌产品的需求大幅增加，我国益生菌产业快速发展，已成为支撑并带动我国食品工业健康转型升级的重要引擎之一。
2、口服益生菌后，胃中强酸性环境(ph 1～3)以及消化酶的存在会增加益生菌细胞壁和细胞膜的渗透性，从而增加它们对损伤的敏感性，使得细胞结构的完整性在胃中受到严重破坏。因此，除耐酸益生菌外，大多数益生菌在胃中都会失活，从而导致其活力显著下降。肠液中含有的消化液也可以作用于微生物细胞膜，提高细胞膜通透性，导致细胞内容物外流和细胞死亡。此外，肠道含有大量的微生物，它们可以与益生菌竞争生存，进而影响益生菌的生存。因此，胃的低ph值、酶降解、胆盐的抗菌活性以及与其他细菌的竞争，这些因素会导致益生菌大量死亡，使得益生菌在胃肠道的定植和增殖受到限制，进而导致其益生功能下降。因此，要如何保护益生菌在充满“危险”的环境中活下来是当前益生菌产业面临的巨大挑战。
3、所以我们提出了一种益生菌单细胞封装方法，以便于解决上述中提出的问题。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种益生菌单细胞的封装方法以及封装所得的益生菌，由该封装方法所得的益生菌具有耐酸、抗氧化和强黏附的效果，能有效解决益生菌在胃肠道的定植和增殖受到限制的问题。
2、本发明的目的通过如下技术方案实现：
3、一种具有耐酸、抗氧化和强黏附的益生菌单细胞的封装方法，包括以下步骤：
4、(1)将益生菌重悬在缓冲液中，制成益生菌液；
5、(2)向步骤(1)所得的益生菌液中加入金属盐水溶液，涡旋；
6、(3)向步骤(2)所得的溶液中加入多酚溶液，涡旋，得菌悬液；
7、(4)将步骤(3)所得的菌悬液离心；
8、(5)用pbs缓冲液重悬离心，去除未结合的多酚，得到封装完成后的益生菌即封装益生菌；
9、其中，在益生菌液、金属盐水溶液以及多酚溶液混合形成的封装体系中，益生菌液的浓度为：1×107-1×109cfu/ml，金属离子浓度为0.004-1mmol/ml，多酚所含的羟基浓度为0.002-0.05mmol/ml，且整个体系中金属离子的摩尔浓度不小于多酚溶液中多酚所含有的羟基摩尔浓度。
10、多酚采用pbs(ph 7.4)缓冲液溶解呈多酚溶液。所述pbs(ph 7.4)缓冲液由磷酸氢二钠，磷酸二氢钾，氯化钠，氯化钾组成，ph7.4。
11、其中，步骤(1)的操作方法为：
12、将培养好的益生菌用pbs缓冲液清洗三次，取1×107-1×109cfu/ml的益生菌重悬在450μlpbs缓冲液中，缓冲液的ph值为7.4，涡旋15s以使菌体分散均匀。
13、步骤(2)的操作方法为：在步骤(1)所得的益生菌液中加入50μl金属盐水溶液，迅速涡旋15s。
14、步骤(3)的操作方法为：在步骤(2)所得的溶液中加入500μl多酚溶液，涡旋15s，得菌悬液。
15、步骤(4)的操作方法为：
16、将步骤(3)所得的菌悬液12000rpm/min离心5-10min；
17、步骤(5)的操作方法为：
18、用pbs缓冲液重悬步骤(4)所得的产物3次并离心5000-12000rpm/min，5-10min后，以去除未结合的多酚，得到封装完成后的益生菌即封装益生菌。
19、所述多酚为茶多酚、原花青素、鞣花酸或儿茶素类化合物中的一种或几种的混合。
20、所述儿茶素类化合物为表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)、表儿茶素没食子酸酯(ecg)、表没食子儿茶素(egc)、表儿茶素(ec)中的一种或几种的混合。
21、所述金属盐水溶液为过渡金属盐的水溶液；所述过渡金属盐为锌盐、铁盐、锰盐中的一种或几种的混合。
22、所述的锌盐可以为醋酸锌、硫酸锌、葡萄糖酸锌等，所述铁盐可以为硫酸铁、氯化铁、硫酸亚铁等，所述的锰盐为氯化锰、硫酸锰等。
23、对应的金属离子为锌离子、铁离子以及锰离子等。
24、所述益生菌为发酵粘液乳杆菌、唾液联合乳杆菌、地衣芽孢杆菌、鼠李糖乳酪杆菌、副干酪乳酪杆菌、植物乳植杆菌、嗜热链球菌中的任意一种或几种的混合。
25、本发明还提供一种所述封装方法封装所得的封装益生菌。
26、本发明封装所得的益生菌在制备口服益生菌产品中的应用。
27、多酚可与多价金属(如fe、ti、mn和cr等)的离子通过配位键络合形成超分子三维网络结构，即金属-酚网络结构(mpn)。虽然mpn已有较多的研究，但没有通过金属-酚网络结构封装益生菌来同步提升益生菌耐酸性、胃肠道环境耐受性、抗氧化和强黏附的相关报道。研究表明，由单宁酸构成的mpn结构在ph 2时会立即解体，因此该结构无法在胃酸中为益生菌提供足够的保护，而目前解决该难题方法则是采用工艺较为复杂的双层封装，即在mpn外层再添加一层具有抗酸性能的材料，而该方法通常具有工艺繁琐、成本高等缺点。而本发明通过探究益生菌、金属离子、多酚的混合比例，利用金属离子/多酚配位配合物对益生菌进行封装，形成的封装层成功赋予益生菌耐酸性、抗氧化和强黏附的特性，封装成的益生菌以及封装方法有望用于口服益生菌产品制备中的应用。
28、较之现有技术而言，本发明的优点在于：
29、发明利用金属离子/多酚配位配合物对益生菌进行封装，并通过探究益生菌、金属离子、多酚的混合比例，成功封装并形成具有显著耐酸性、抗氧化和强黏附的益生菌即封装益生菌，所述封装方法以及封装成的益生菌有望用于口服益生菌产品制备中的应用。
30、本发明的耐酸、抗氧化和强黏附的益生菌单细胞封装方法，制备条件温和，工艺简单易行，保证了益生菌的活性。所采用的多酚和金属盐廉价易得，且金属和多酚配位形成的网络结构可以增强益生菌对外界环境的抗性，透射电镜和共聚焦显微镜表明涂层成功。
1.一种具有耐酸、抗氧化和强黏附的益生菌单细胞的封装方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的封装方法，其特征在于：步骤(1)的操作方法为：
3.根据权利要求2所述的封装方法，其特征在于：步骤(2)的操作方法为：在步骤(1)所得的益生菌液中加入50μl金属盐水溶液，迅速涡旋15s。
4.根据权利要求3所述的封装方法，其特征在于：步骤(3)的操作方法为：在步骤(2)所得的溶液中加入500μl多酚溶液，涡旋15s，得菌悬液。
5.根据权利要求4所述的封装方法，其特征在于：步骤(4)的操作方法为：将步骤(3)所得的菌悬液12000rpm/min离心5-10min。
6.根据权利要求5所述的封装方法，其特征在于：步骤(5)的操作方法为：用pbs缓冲液重悬步骤(4)所得的产物3次并离心5000-12000rpm/min，5-10min后，以去除未结合的多酚，得到封装完成后的益生菌即封装益生菌。
7.根据权利要求1所述的封装方法，其特征在于：所述多酚为茶多酚、原花青素、鞣花酸或儿茶素类化合物中的一种或几种的混合。
8.根据权利要求7所述的封装方法，其特征在于：所述儿茶素类化合物为表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)、表儿茶素没食子酸酯(ecg)、表没食子儿茶素(egc)、表儿茶素(ec)中的一种或几种的混合。
9.根据权利要求1所述的细胞封装方法，其特征在于：所述金属盐水溶液为过渡金属盐的水溶液；所述过渡金属盐为锌盐、铁盐、锰盐中的一种或几种的混合。
10.一种由权利要求1-9任意一项所述的封装方法封装成的封装益生菌。
