本发明属于分析化学，具体涉及一种分离、测定左亚叶酸钙中间体z2及其有关杂质的方法。
背景技术：
1、左亚叶酸钙中间体z2是左亚叶酸钙合成过程中的关键中间体，其中文化学名为(6ar)-3-氨基-8-[4-[[(2s)-1,3-二羧基丙基]氨甲酰基]苯基]-1-氧代-2,5,6,6a,7,8-八氢-1h-咪唑并[1,5-f]蝶啶-10-氯化物，分子式为c20h22cln7o6；分子量为528.35；结构式如式ⅰ所示。
2、
3、研究证实，左亚叶酸钙中间体z2中可能存在杂质z1、杂质a、杂质z2b、左亚叶酸钙等杂质，左亚叶酸钙的结构式如式ⅱ所示，杂质z1的结构式如式ⅲ所示，杂质a的结构式如式ⅳ所示，杂质z2b的结构式如式ⅴ所示。
4、
5、杂质a为药典杂质，在各个反应步骤中均进行控制，考察其在各步反应中的消除情况。杂质z2b具警示结构芳胺，为基毒杂质。在中间体z1合成z2反应过程中，z1中的杂质z1b(具警示结构芳胺，其结构式如式vi所示)与甲酸生成的副产物为杂质z2b，属于工艺杂质；并且z2水解也产生杂质z2b。因为杂质z1b在中间体z1中存在水平较高(控制限度为不得过0.2％)，加上本步反应中z2水解产生z2b，所以有必要追踪其后续副产物z2b的生成情况并进行质量控制(控制限度为不得过0.5％)，杂质z2b在成品最终生成杂质e(ep药典法定杂质，控制限度为不得过0.3％)。
6、
7、部分现有技术公开了左亚叶酸钙或其中间体中相关物质的分析方法，如cn114324618a专利公开了分离检测左亚叶酸钙中间体及相关物质的方法，该发明采用的色谱柱是以辛烷基键合硅胶为填料，采用乙酸铵缓冲溶液和有机溶液进行梯度洗脱，将左亚叶酸钙中间体及相关物质进行分离。cn102841169b专利公开了一种高效液相色谱梯度法测定左亚叶酸钙有关物质的方法，其以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以磷酸盐缓冲液为流动相a，以磷酸盐缓冲液-甲醇为流动相b，通过梯度洗脱分离检测左亚叶酸钙中的(2s)-2-[(4-氨基苯甲酰)氨基]戊二酸、(2s)-2-[[4-[[(2-氨基-4-氧代-1，4-二氢-6-蝶啶基)甲基]氨基]苯甲酰基]氨基]戊二酸、(2s)-2-[[4-[[(2-氨基-4-氧代-1，4-二氢-6-蝶啶基)甲基]甲酰氨基]苯甲酰基]氨基]戊二酸和2s)-2-[[4-[[(2-氨基-4-氧代-1，4，7，8-四氢-6-蝶啶基)甲基]氨基]苯甲酰基]氨基]戊二酸。然而这些方法均无法实现左亚叶酸钙中间体z2中杂质z1、杂质a、杂质z2b、左亚叶酸钙的有效检测。
8、因此，亟需寻找一种新的方法，来实现左亚叶酸钙中间体z2中杂质z1、杂质a、杂质z2b、左亚叶酸钙的分离和检测，这对左亚叶酸钙药物的质量控制具有重要意义。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种hplc法分离左亚叶酸钙中间体z2及其杂质的方法，该方法可在大于50分钟的时间或50分钟内实现左亚叶酸钙中间体z2及其杂质的有效分离，为后续左亚叶酸钙中间体z2及其杂质的定性和定量提供支持。
2、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
3、hplc法分离左亚叶酸钙中间体z2及其杂质的方法，所述杂质包括杂质a、杂质z1、杂质z2b、左亚叶酸钙中的任一种或多种；所述hplc法的色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相包括流动相a和流动性b，所述流动相a为磷酸盐缓冲液，所述流动相b为甲醇；通过梯度洗脱依次将杂质a、杂质z1、杂质z2b、左亚叶酸钙中间体z2和/或左亚叶酸钙进行分离；
4、所述左亚叶酸钙中间体z2的结构式如式ⅰ所示，所述左亚叶酸钙的结构式如式ⅱ所示，所述杂质z1的结构式如式ⅲ所示，所述杂质a的结构式如式ⅳ所示，所述杂质z2b的结构式如式ⅴ所示；
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6、进一步，各组分被洗脱的顺序依次为：杂质a、杂质z1、杂质z2b、左亚叶酸钙中间体z2、左亚叶酸钙。
7、进一步，所述梯度洗脱的程序如下：
8、0分钟，设置所述流动相a和所述流动性b的体积比为92-98:8-2；
9、8分钟，设置所述流动相a和所述流动性b的体积比为92-98:8-2；
10、20分钟，设置所述流动相a和所述流动性b的体积比为85-95:15-5；
11、38分钟，设置所述流动相a和所述流动性b的体积比为85-95:15-5；
12、42分钟，设置所述流动相a和所述流动性b的体积比为80-90:20-10；
13、42.1分钟，设置所述流动相a和所述流动性b的体积比为92-98:8-2；
14、50分钟，设置所述流动相a和所述流动性b的体积比为92-98:8-2。
15、优选地，所述梯度洗脱的程序如下：
16、0分钟，设置所述流动相a和所述流动性b的体积比为94.5-95.5：5.5-4.5；
17、8分钟，设置所述流动相a和所述流动性b的体积比为94.5-95.5：5.5-4.5；
18、20分钟，设置所述流动相a和所述流动性b的体积比为90:10；
19、38分钟，设置所述流动相a和所述流动性b的体积比为90:10；
20、42分钟，设置所述流动相a和所述流动性b的体积比为85:15；
21、42.1分钟，设置所述流动相a和所述流动性b的体积比为94.5-95.5：5.5-4.5；
22、50分钟，设置所述流动相a和所述流动性b的体积比为94.5-95.5：5.5-4.5。
23、最优选地，所述梯度洗脱的程序如下：
24、0分钟，设置所述流动相a和所述流动性b的体积比为95:5；
25、8分钟，设置所述流动相a和所述流动性b的体积比为95:5；
26、20分钟，设置所述流动相a和所述流动性b的体积比为90:10；
27、38分钟，设置所述流动相a和所述流动性b的体积比为90:10；
28、42分钟，设置所述流动相a和所述流动性b的体积比为85:15；
29、42.1分钟，设置所述流动相a和所述流动性b的体积比为95:5；
30、50分钟，设置所述流动相a和所述流动性b的体积比为95:5。
31、进一步，所述流动相a的浓度为0.01-0.03mol/l，ph为3.0-3.5；优选地，所述流动相a的浓度为0.02mol/l，ph为3.2-3.4；ph最优选为3.3。
32、进一步，所述流动性的流速为1.4-1.6ml/min，优选为1.5ml/min；色谱柱的柱温为43-47℃，优选为45℃。
33、优选地，进样体积为20μl。
34、优选地，色谱柱优选agilent zorbax sb-c18，规格为4.6mm×250mm，5μm。
35、优选地，运行时间为50分钟。
36、本发明的目的之二在于提供一种鉴定左亚叶酸钙中间体z2中杂质的方法，该方法可以检出左亚叶酸钙中间体z2中含量为0.01％的杂质，检测限低。
37、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
38、鉴定左亚叶酸钙中间体z2中杂质的方法，所述杂质包括所述杂质a、所述杂质z1、所述杂质z2b中的任一种或多种；所述方法包括：采用前述方法对左亚叶酸钙中间体z2及其杂质进行分离；进入检测器进行检测，得到色谱图；将检测品的色谱图和已知对照品的色谱图进行对比，判断检测品中是否含有所述杂质a、杂质z1、杂质z2b中的任一种或多种。
39、进一步，所述检测器的检测波长为300±10nm；优选地，检测波长为300nm。
40、进一步，各组分保留时间由短到长依次为：杂质a、杂质z1、杂质z2b、左亚叶酸钙中间体z2、左亚叶酸钙。
41、可以根据保留时间的长短对各组分进行定性。
42、进一步，以左亚叶酸钙中间体z2为参照峰，相对保留时间为0.34±0.02，判定为杂质a；相对保留时间为0.67±0.02，判定为杂质z1；相对保留时间为0.88±0.02，判定为杂质z2b。
43、进一步，当保留时间为7.3±0.5min，判定为杂质a；当保留时间为14.3±0.5min，判定为杂质z1；当保留时间为19.0±0.5min，判定为杂质z2b；当保留时间为21.8±0.5min，判定为左亚叶酸钙中间体z2。
44、本发明的目的之三在于提供一种测定左亚叶酸钙中间体z2中杂质含量的方法，该方法可以有效测定左亚叶酸钙中间体z2中含量为0.02％的杂质，定量限低，灵敏度高。
45、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
46、测定左亚叶酸钙中间体z2中杂质含量的方法，所述杂质包括所述杂质a、所述杂质z1、所述杂质z2b中的任一种或多种；所述方法包括如下步骤：
47、(1)利用前述方法对左亚叶酸钙中间体z2及其杂质进行分离并检测，得到色谱图；
48、(2)根据步骤(1)测得的色谱图，采用面积归一化法计算左亚叶酸钙中间体z2及其杂质的含量。
49、进一步，采用乙腈、水、巯基乙醇的组合作为样品配制溶剂，所述溶剂中，乙腈、水和巯基乙醇的体积比为90-110:890-910:8-12。
50、优选地，所述溶剂中，乙腈、水和巯基乙醇的体积比为100:900:10。
51、进一步，供试品溶液的浓度为2.0mg/ml。
52、优选地，采用如下色谱条件进行测定：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱规格为4.6mm×250mm，5μm；流动相a为浓度为0.02mol/l、ph为3.2-3.4的磷酸盐缓冲液，流动相b为甲醇；流速为1.4-1.6ml/min，柱温为43-47℃；检测波长为300nm；采用如下梯度洗脱程序进行洗脱并得到色谱图：
53、0分钟，设置所述流动相a和所述流动性b的体积比为94.5-95.5：5.5-4.5；
54、8分钟，设置所述流动相a和所述流动性b的体积比为94.5-95.5：5.5-4.5；
55、20分钟，设置所述流动相a和所述流动性b的体积比为90:10；
56、38分钟，设置所述流动相a和所述流动性b的体积比为90:10；
57、42分钟，设置所述流动相a和所述流动性b的体积比为85:15；
58、42.1分钟，设置所述流动相a和所述流动性b的体积比为94.5-95.5：5.5-4.5；
59、50分钟，设置所述流动相a和所述流动性b的体积比为94.5-95.5：5.5-4.5。
60、优选地，测定方法包括如下步骤：
61、1.取本品适量，精密称定，加稀释剂使溶解，再加等体积的水稀释制成浓度为2.0mg/ml的溶液，作为样品溶液；
62、2.取左亚叶酸钙中间体z2、杂质a、杂质z2b、杂质z1及左亚叶酸钙对照品适量，加稀释剂使溶解，再加等体积的水稀释制成每1ml中约含杂质a、杂质z2b、z1及左亚叶酸钙各10μg和z2约2.0mg的溶液，作为系统适用性溶液；
63、3.分别取上述系统适用性溶液、样品溶液，如20μl，分别注入液相色谱仪进行检测，得到色谱图；采用峰面积归一化法计算各杂质的含量。
64、本发明的有益效果在于：
65、1.本发明方法能够实现左亚叶酸钙中间体z2中杂质a、杂质z1、杂质z2b及其他单个杂质的有效测定，可在50分钟将左亚叶酸钙中间体z2中杂质a、杂质z1、杂质z2b、左亚叶酸钙同时分离，具有分离时间短的特点。
66、2.本发明自建高效液相色谱法，本方法可以有效检出左亚叶酸钙中间体z2中水平为0.01％的杂质，可有效定量左亚叶酸钙中间体z2中水平为0.02％的杂质，本方法灵敏度高。
67、3.本发明采用梯度洗脱高效液相色谱法，缓冲盐使用简单的磷酸盐，有机相使用甲醇，色谱柱使用常规十八烷基硅烷键合硅胶为填料的sb-c18柱，测定左亚叶酸钙中间体z2的有关物质，通过本色谱条件进行检测，使主成分峰型较为对称，各杂质能够有效分离，得到准确的杂质含量。本方法简单，专属性强，灵敏度高，重现性好。并且本发明方法可对离子型化合物采用简单的面积归一化法进行测定和计算，从而确保了左亚叶酸钙的质量可控，并最终确定产品的安全有效，对于左亚叶酸钙的质量控制有重要意义。
1.hplc法分离左亚叶酸钙中间体z2及其杂质的方法，其特征在于，所述杂质包括杂质a、杂质z1、杂质z2b、左亚叶酸钙中的任一种或多种；所述hplc法的色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相包括流动相a和流动性b，所述流动相a为磷酸盐缓冲液，所述流动相b为甲醇；通过梯度洗脱依次将杂质a、杂质z1、杂质z2b、左亚叶酸钙中间体z2和/或左亚叶酸钙进行分离；
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱的程序如下：
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相a的浓度为0.01-0.03mol/l，ph为3.0-3.5。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动性的流速为1.4-1.6ml/min，色谱柱的柱温为43-47℃。
5.鉴定左亚叶酸钙中间体z2中杂质的方法，其特征在于，所述杂质包括所述杂质a、所述杂质z1、所述杂质z2b中的任一种或多种；所述方法包括：采用权利要求1-4任一项所述的方法对左亚叶酸钙中间体z2及其杂质进行分离；进入检测器进行检测，得到色谱图；将检测品的色谱图和已知对照品的色谱图进行对比，判断检测品中是否含有所述杂质a、杂质z1、杂质z2b中的任一种或多种。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述检测器的检测波长为300±10nm。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，以左亚叶酸钙中间体z2为参照峰，相对保留时间为0.34±0.02，判定为杂质a；相对保留时间为0.67±0.02，判定为杂质z1；相对保留时间为0.88±0.02，判定为杂质z2b。
8.测定左亚叶酸钙中间体z2中杂质含量的方法，其特征在于，所述杂质包括所述杂质a、所述杂质z1、所述杂质z2b中的任一种或多种；所述方法包括如下步骤：
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，采用乙腈、水、巯基乙醇的组合作为样品配制溶剂，所述溶剂中，乙腈、水和巯基乙醇的体积比为90-110:890-910:8-12。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，采用如下色谱条件进行测定：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱规格为4.6mm×250mm，5μm；流动相a为浓度为0.02mol/l、ph为3.2-3.4的磷酸盐缓冲液，流动相b为甲醇；流速为1.4-1.6ml/min，柱温为43-47℃；检测波长为300nm；采用如下梯度洗脱程序进行洗脱并得到色谱图：0分钟，设置所述流动相a和所述流动性b的体积比为94.5-95.5：5.5-4.5；
