本发明属于动物基因工程领域，涉及一种羊rab7基因在抗小反刍兽疫病毒中的应用。
背景技术：
1、小反刍兽疫(peste des petits ruminants,ppr)俗称羊瘟，是由副黏病毒科麻疹病毒属的小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,pprv)感染山羊、绵羊等小反刍动物而引起的急性病毒性传染病。小反刍兽疫主要表现为急性胃炎、支气管肺炎、肠炎和怀孕母羊流产，目前该病已经成为一种地方性流行疫病，直接制约着养羊业发展。
2、有研究表明，pprv感染细胞可产生携带病毒基因组的外泌体，通过外泌体的细胞间传播造成pprv感染(参见《pprv-induced autophagy facilitates infectiousvirustransmission by the exosomal pathway》)，结合其他研究可知，pprv感染源外泌体可使得吸纳细胞的pprv感染水平升高(参见《microrna-218regulates signalinglymphocyte activation molecular(slam)mediated peste des petits ruminantsvirus infectivity in goat peripheral blood mononuclear cells》以及《extracellular vesicles derived from pprv infected cells enhance signalinglymphocyte activation molecular(slam)receptor expression and facilitate virusinfection》)。
3、rab7位于早期内体(ees)和晚期内体(les)/多泡体(mvbs)中，又名rab7a，已被证明是内吞转运和溶酶体降解的重要组成部分。有研究表明rab7可以调节早期内体的运输过程，同时有报道称rab7主要影响晚期内体向溶酶体成熟的过程，从而影响外泌体的生成和释放。
4、尽管前期研究表明，pprv感染会影响rab7的表达水平(参见《ifitm在小反刍兽疫病毒(pprv)感染早期的作用研究》)，但由于pprv感染细胞后1～3h是其完成进入(如1.5h)以及引起第一波自噬的时间点(参见《peste des petits ruminants virus enterscaprine endometrial epithelial cells via the caveolae-mediated endocytosispathway》以及《autophagy induction by the pathogen receptor nectin4 andsustained autophagy contribute to peste des petits ruminants virusinfectivity》)，因此该研究实际上探究了pprv入侵过程(pprv感染山羊子宫内膜上皮细胞后2h)中rab7的表达水平变化，以及调控rab7基因对pprv进入的影响，尚无法确定rab7基因对pprv感染后复制水平的影响，也未揭示rab7基因在制备高效的病毒扩增细胞等方面的潜在价值。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种抗小反刍兽疫病毒羊rab7基因的应用。
2、为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
3、一种rab7基因过表达载体在制备用于抗小反刍兽疫病毒的药物中的应用，所述表达载体包括羊rab7基因。
4、优选的，所述羊rab7基因来自山羊。
5、优选的，所述羊rab7基因的核苷酸序列如seq.id.no.1所示，可以用于实现真核表达(如在羊体细胞中的表达)。
6、优选的，所述表达载体是通过将羊rab7基因插入pcdna3.1(+)载体而制得的。
7、优选的，所述表达载体的制备方法包括以下步骤：
8、1)以羊rab7基因为目的基因，将目的基因扩增后与表达载体骨架进行连接反应，得连接产物；
9、2)将连接产物转化宿主菌后进行抗性筛选，将筛选获得的单克隆经菌落pcr鉴定后进行培养，培养后提取质粒进行酶切和测序验证，验证为正确的质粒即rab7基因过表达载体。
10、优选的，所述步骤1中，目的基因的核苷酸序列如seq.id.no.1所示。
11、优选的，所述步骤1中，扩增采用的引物如seq.id.no.2和seq.id.no.3所示。
12、优选的，所述步骤1中，表达载体骨架具体是通过将pcdna3.1(+)载体经notⅰ/xbai双酶切进行线性化而制得的，将pcdna3.1(+)线性化载体片段回收后与目的基因连接以构建rab7基因过表达载体(如重组质粒pcdna3.1-rab7)。
13、优选的，所述表达载体(即过表达羊rab7基因)抑制小反刍兽疫病毒的复制。
14、优选的，所述表达载体(即过表达羊rab7基因)通过抑制小反刍兽疫病毒感染复制周期(感染后9～12h)细胞中病毒的复制水平升高而达到抗病毒功效。
15、一种制备高滴度小反刍兽疫病毒的方法，包括以下步骤：
16、将干扰羊rab7基因表达的sirna转染进宿主羊细胞，得干扰细胞；利用小反刍兽疫病毒感染所得干扰细胞，对感染小反刍兽疫病毒后的干扰细胞进行培养，自感染后9h开始细胞培养上清中病毒滴度显著高于正常感染(即感染未敲降rab7基因的宿主羊细胞)后培养所得细胞培养上清中病毒滴度，培养结束(即培养≥9h)后分离细胞培养上清，即得到高滴度的小反刍兽疫病毒。
17、优选的，所述sirna的核苷酸序列如下所示：
18、sense：5’-caacuaauuuccugaaccu-3’
19、antisense：5’-agguucaggaaauucguug-3’。
20、优选的，所述小反刍兽疫病毒选自小反刍兽疫病毒疫苗弱毒毒株n75-1。
21、优选的，所述宿主羊细胞为山羊子宫内膜上皮细胞。
22、一种病毒扩增细胞，该细胞是经小反刍兽疫病毒感染的敲降rab7基因表达的宿主羊细胞。
23、优选的，所述细胞具体是通过在转染上述干扰羊rab7基因表达的sirna后感染小反刍兽疫病毒而构建得到的，将构建所得细胞进行培养后即可获得高滴度的小反刍兽疫病毒，有助于更好的研究小反刍兽疫病毒的致病机制和更高效地扩增小反刍兽疫病毒疫苗毒株。
24、本发明的有益效果体现在：
25、本发明基于小反刍兽疫病毒(如疫苗株n75-1)感染不同时期宿主羊细胞(如山羊子宫内膜上皮细胞)中小反刍兽疫病毒复制水平和rab7表达水平的动态变化，首次将羊rab7基因鉴定为一种针对小反刍兽疫的抗病基因，并揭示rab7蛋白水平与小反刍兽疫病毒复制水平呈负相关特性，可以通过在羊体细胞过表达rab7基因实现抗病毒活性，以及通过对羊体细胞rab7基因的干扰，实现小反刍兽疫病毒感染后的快速复制并获得高滴度的小反刍兽疫病毒，从而不仅为小反刍兽疫病毒致病机制研究和小反刍兽疫病毒灭活疫苗、减毒疫苗制备提供高效的病毒扩增细胞，而且为小反刍兽疫的防控提供新思路。
1.一种rab7基因过表达载体在制备用于抗小反刍兽疫病毒的药物中的应用，其特征在于：所述表达载体包括羊rab7基因。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述羊rab7基因来自山羊。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述羊rab7基因的核苷酸序列如seq.id.no.1所示。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述表达载体是通过将羊rab7基因插入pcdna3.1(+)载体而制得的。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述表达载体的制备方法包括以下步骤：
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述表达载体抑制小反刍兽疫病毒的复制。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述表达载体抑制小反刍兽疫病毒感染复制周期病毒复制水平升高。
8.一种制备高滴度小反刍兽疫病毒的方法，其特征在于：包括以下步骤：
9.根据权利要求8所述一种制备高滴度小反刍兽疫病毒的方法，其特征在于：所述sirna的核苷酸序列如下所示：
10.一种病毒扩增细胞，其特征在于：该细胞是经小反刍兽疫病毒感染的敲降rab7基因表达的宿主羊细胞。
