本发明涉及pcr扩增，特别是涉及一种乳液pcr单分子扩增效率评价方法。
背景技术：
1、乳液pcr(empcr)扩增是一种基于油包水液滴的pcr扩增技术，将扩增dna片段与含有相应引物在内的扩增体系水相物料通过不相溶的油相分散为数量庞大的油包水液滴，然后以单个小液滴为反应器进行独立的扩增反应，进而实现dna片段的平行扩增，可以有效的避免其他竞争性或污染性序列的影响，如何评价扩增效率对乳液pcr体系优劣具有重要指导意义。
2、目前对乳液pcr扩增效率评价主要有几种方法：1.实时荧光定量pcr；2.聚丙烯酰胺凝胶电泳分析法；3.固相微球或磁珠扩展法，信号测序分析；4.破乳后使用凝胶电泳仪进行定量分析；4.流式细胞仪；5.数字pcr。
3、其中qpcr和凝胶电泳分析法，前者需要体系对所需波长荧光有良好的光透过性，后者需要较为澄清溶液，不适用于empcr，而且这两种方式只能对整个体系的扩增效率进行定量分析；其余的破乳回收法以及固相磁珠分析测序法，虽然也可以分析empcr体系，但是不仅需要破乳分离回收，而且需要进一步采用信号分析或其它分析手段，操作麻烦、成本高昂；流式细胞仪和数字pcr虽然可以分析empcr体系，操作也方法，但是只能测定万颗液滴级尺度的乳液，具有极大的局限性。
4、以上所述的乳液扩增评价方法中，没法做到定量分析，需要繁琐的仪器和程序，在测定尺度上受限，会对乳液pcr扩增效率的评价造成很大影响，目前急需开发一种即时准确的乳液pcr扩增效率评价方法。
技术实现思路
1、针对上述问题，本发明提供了一种乳液pcr单分子扩增效率评价方法，具有操作简单，准确可靠的优点。
2、本发明的技术方案是：
3、一种乳液pcr单分子扩增效率评价方法，其包括如下步骤：
4、s1、配制多个不同的乳液pcr体系并在同条件下分别进行扩增；
5、s2、对不同乳液pcr体系下扩增后的乳液分别计算其扩增效率；
6、s3、比对不同乳液pcr体系下的乳液扩增效率，确定最优乳液pcr体系；
7、s4、对步骤s3确定的最优乳液pcr体系下扩增的乳液的液滴分布情况分析，确定扩增的最佳模板数。
8、所述步骤s1，乳液pcr体系包括生物油相、pcr预混液。
9、所述步骤s2，每种乳液pcr体系下扩增后的乳液的扩增效率计算方法如下：
10、1)将扩增后的乳液放置在荧光拍摄装置中拍照，获得同一视野和不同视野的荧光图片；
11、2)提取荧光图片，计算荧光值，通过荧光值换算扩增效率；
12、所述步骤s2，需要在保证模板数过量的情况下进行计算。
13、所述步骤s3，最优乳液pcr体系确定方法如下：
14、比较不同乳液pcr体系下扩增后的乳液的扩增效率；
15、扩增荧光值＝实验荧光值-空白背景荧光值：
16、扩增荧光数值越大，扩增效率越高，扩增效率越高的乳液pcr体系越佳。
17、所述步骤s4，最佳模板数确定方法如下：
18、a在最佳乳液pcr体系中加入不同的模板数，并获取在每一种不同模板数下扩增后不同视野的荧光图片和明场图片，分别计算扩增比例；
19、b比较不同模板数条件下的扩增比例，得出每种模板数条件下乳液的液滴总数；
20、c根据步骤b得出的每种模板数条件下乳液的液滴总数，得出单扩增效率最佳的模板数；
21、所述荧光图片用于统计扩增液滴数，所述明场图片用于统计总液滴数。
22、所述步骤b中的液滴总数采用柏松分布反推得到。
23、所述步骤s4还包括对最佳模板数的验证，所述验证采用在体系中加入探针、染料或模板，获取不同荧光通道下的液滴荧光，比较单个液滴的扩增情况进而验证整体液滴的单扩增效率。
24、本发明的有益效果是：
25、本方法能直观判断出乳液的扩增效率，操作简单，仅需pcr仪(或加热装置)及荧光显微镜即可完成，不需要其他复杂的设备和流程。通过相同视野液滴的荧光强度或者灰度值可以比较不同单个液滴尺度的扩增情况；通过多个视野下的大量的数量统计可以准确的评价及计算整体的扩增效率；通过对照泊松分布公式不仅可以核对整体的液滴个数，单扩增效率，同时可以指导加入的最佳模板数；通过两种荧光下视野下的液滴情况可以验证其单扩增情况，可以及时准确的统计乳液的扩增效率，快速指导扩增调节实验中pcr mix，生物油和模板等不同成分。
1.一种乳液pcr单扩增效率评价方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种乳液pcr单分子扩增效率评价方法，其特征在于，所述步骤s1，乳液pcr体系包括生物油相、pcr预混液。
3.根据权利要求1所述的一种乳液pcr单分子扩增效率评价方法，其特征在于，所述步骤s2，每种乳液pcr体系下扩增后的乳液的扩增效率计算方法如下：
4.根据权利要求1所述的一种乳液pcr单分子扩增效率评价方法，其特征在于，所述步骤s3，最优乳液pcr体系确定方法如下：
5.根据权利要求1所述的一种乳液pcr单分子扩增效率评价方法，其特征在于，所述步骤s4，最佳模板数确定方法如下：
6.根据权利要求5所述的一种乳液pcr单分子扩增效率评价方法，其特征在于，所述步骤b中的液滴总数采用柏松分布反推得到。
7.根据权利要求5所述的一种乳液pcr单分子扩增效率评价方法，其特征在于，所述步骤s4还包括对最佳模板数的验证，所述验证采用在体系中加入探针、染料或模板，获取不同荧光通道下的液滴荧光，比较单个液滴的扩增情况进而验证整体液滴的单扩增效率。
