本发明涉及细胞冻存，尤其涉及一种无毒副作用的car-t细胞冻液及其应用。
背景技术：
1、免疫细胞治疗是继手术、化疗、放疗和靶向疗法后出现的一种新型疗法，被称为治疗癌症的“第五大疗法”。
2、car-t免疫细胞治疗(ch imer i c ant i gen receptor t-ce l limmunotherapy，嵌合抗原受体t细胞免疫疗法)，是利用基因工程技术手段，特异性改造患者自身的免疫t细胞，使其能够识别肿瘤细胞，从而实现特异性杀伤的作用。
3、提取-制备-扩增方式获得car-t细胞的时间较长，在获得car-t细胞后，容易因治疗因素发生变化导致不能及时使用新鲜制得的car-t细胞，因此car-t细胞通常会进行冻存。在维持car-t细胞生物学活性不变的情况下，如何使car-t细胞获得长期有效的保存是值得关注的问题。
4、细胞冻存技术作为一种保存细胞的有效方法，在生物学领域已有深入广泛的应用。因为正常情况下，直接冷冻细胞会产生冰晶对细胞造成伤害，从而导致细胞死亡。所以需要通过添加冻存保护剂配制细胞冻存液，来保护细胞。
5、目前，最常见的冻存保护剂为二甲基亚砜(dmso)，是一种高渗透溶剂，可迅速渗入细胞，提高细胞膜对水的通透性，使水分在细胞冻结前透出细胞外形成冰晶，为细胞冻存最理想的冷冻保护剂。但是，由于低浓度dmso在常温下对细胞有一定毒性，会造成细胞结构和功能的不可逆损伤。
技术实现思路
1、鉴于上述问题，本发明所要解决的问题在于提供一种使用安全且对细胞无毒副作用的car-t细胞冻存液及使用该冻存液进行细胞冻存的方法。
2、本发明的技术方案如下：
3、一种car-t细胞冻存液，包括白及多糖5-15w/v％、海藻酸钠3-10w/v％、左旋肉碱6-14w/v％、西黄蓍胶3-8w/v％、人血白蛋白溶液10-30v/v％，其余为复方电解质注射液。
4、较好地，一实施例中，所述car-t细胞冻存液包括白及多糖10w/v％、海藻酸钠6w/v％、左旋肉碱9w/v％、西黄蓍胶5w/v％、人血白蛋白溶液20v/v％，其余为复方电解质注射液。
5、再一实施例，在所述car-t细胞冻存液中，每1000ml所述复方电解质注射液中包括氯化钠2-10g、葡萄糖酸钠2-10g、醋酸钠1-6g、氯化钾0.1-0.8g及氯化镁0.1-0.7g，余量为注射用水；优选，每1000ml所述复方电解质注射液中包括氯化钠5.26g、葡萄糖酸钠5.02g、醋酸钠3.68g、氯化钾0.37g及氯化镁0.30g，余量为注射用水。
6、该冻存液在使用时，需要维持复方电解质注射液的ph值为7.0～7.8，因此，还需要在电解质注射液中添加一定量的碱性物质，如，氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化硼等。
7、本发明还提供一种car-t细胞冻存方法，其特征在于，包括如下步骤：
8、将上述冻存液与car-t细胞混合后得到的细胞液装入冻存管中，置于4℃环境中共孵育1h；
9、将冻存管置于程序降温盒中，直接放置在-80℃的环境中，并以1℃/min的降温速率降温至-80℃；
10、降温结束后，直接放置液氮罐中保存，备用。
11、上述car-t细胞冻存方法中，在冻存液与car-t细胞混合时，应控制car-t细胞密度为1.0×106-2.0×107个/ml，或者5.0×106-1.0×107个/ml；如，car-t细胞密度可以为1.0×106个/ml、2.0×106个/ml、3.0×106个/ml、4.0×106个/ml、5.0×106个/ml、6.0×106个/ml、7.0×106个/ml、8.0×106个/ml、9.0×106个/ml、1.0×107个/ml、2.0×107个/ml等。
12、本发明提供的car-t细胞冻存液，其组分西黄蓍胶，可以使细胞悬浮分散，提高冻存液的粘性，可减慢细胞的沉降速度，并可吸附在细胞表面形成阻止细胞聚集结团的屏障，避免细胞外形成冰晶而损伤细胞，同时还可以使白及多糖和左旋肉碱充分发挥保护细胞的效用，从而极好的保持复苏后的细胞回收率、活率、扩增能力和肿瘤杀伤能力。
1.一种car-t细胞冻存液，其特征在于，包括白及多糖5-15w/v％、海藻酸钠3-10w/v％、左旋肉碱6-14w/v％、西黄蓍胶3-8w/v％、人血白蛋白溶液10-30v/v％，其余为复方电解质注射液。
2.根据权利要求1所述的car-t细胞冻存液，其特征在于，包括白及多糖10w/v％、海藻酸钠6w/v％、左旋肉碱9w/v％、西黄蓍胶5w/v％、人血白蛋白溶液20v/v％，其余为复方电解质注射液。
3.根据权利要求1或2所述的car-t细胞冻存液，其特征在于，每1000ml所述复方电解质注射液中包括氯化钠2-10g、葡萄糖酸钠2-10g、醋酸钠1-6g、氯化钾0.1-0.8g及氯化镁0.1-0.7g，余量为注射用水。
4.根据权利要求3所述的car-t细胞冻存液，其特征在于，每1000ml所述复方电解质注射液中包括氯化钠5.26g、葡萄糖酸钠5.02g、醋酸钠3.68g、氯化钾0.37g及氯化镁0.30g，余量为注射用水。
5.根据权利要求3所述的car-t细胞冻存液，其特征在于，所述复方电解质注射液的ph值为7.0～7.8。
6.根据权利要求5所述的car-t细胞冻存液，其特征在于，在所述复方电解质注射液中还添加碱性物质，以维持其ph值为7.0～7.8。
7.根据权利要求6所述的car-t细胞冻存液，其特征在于，所述碱性物质包括氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化硼。
8.一种car-t细胞冻存方法，其特征在于，包括如下步骤：
9.根据权利要求8所述的car-t细胞冻存方法，其特征在于，冻存液与car-t细胞混合时，控制car-t细胞密度为1.0×106-2.0×107个/ml。
