：本发明属于可注射药物，尤其是一种序贯控释双药物负载可注射水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
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背景技术：
1、单一药物不足以治疗某些疾病(如肿瘤疾病、青光眼、视网膜疾病等)。两种或两种以上药物的组合已成为通过协同效应提高临床治疗效果的关键策略。通常，序贯药物控释的策略是通过微球、纳米分子笼、大分子前药、超分子水凝胶等完成时空特异性负载。
2、急性视网膜坏死(arn)是一种需要在临床治疗过程中同时使用抗病毒和抗炎药物的眼科疾病，临床治疗方案是治疗初期先用抗病毒药物，24-48小时后追加一种抗炎药物共同治疗才能达到更好的治疗效果。抗炎药物的开始使用时间是关键，如果过早，会增强病毒复制并导致arn的快速发展；如果太晚，达不到良好的抗炎效果。更昔洛韦(gcv)是一种临床应用的具有抗巨细胞病毒和单纯疱疹病毒活性的病毒dna聚合酶抑制剂，然而，由于其半衰期短，gcv应每周在玻璃体中注射2-3次方能达到治疗效果，创伤性致盲风险较高。地塞米松磷酸钠(dex)是一种高效、持久的糖皮质激素抗炎药。临床治疗方案是在gcv抗病毒治疗开始后的24-48小时内施用dex，二者协同治疗arn，dex开始应用于治疗的时间点至关重要，在此时间点之前应无任何dex出现在病灶部位。
3、天然聚多糖可注射水凝胶基于交联的三维网络，保留大量水分并可原位形成，可应用于生物医学领域的各个方面，如药物、细胞和其他生物活性物质的递送。在药物递送领域，与全身给药相比，载药的可注射水凝胶通过注射到病灶位置实现靶向治疗，并且它们还表现出持续的药物释放行为，降低了外部给药频率。
4、金属有机框架(mofs)是由金属离子或簇与有机配体通过配位键组装而成的多孔晶体材料。这些结构具有简单的合成方法、大的比表面积、高孔隙率、可控的孔结构以及对客体分子的强大封装能力，使其在药物输送应用中具有广阔的前景。然而，传统的mofs材料表现出明显的生物毒性，限制了其在生物医学领域的应用。而环糊精具有良好的生物相容性和结构强度，可用于合成基于环糊精的金属有机框架，但需经过一定的改性提高其水稳定性。
5、壳聚糖纳米颗粒作为药物载体近年来受到广泛关注，而透明质酸(ha)可以通过覆盖纳米颗粒的表面来提高颗粒在血清中的稳定性，因此，可以将其用于包覆壳聚糖纳米颗粒，以延长药物在体内的保留时间，提高其生物利用度。例如，mohd abul kalam采用离子凝胶法制备了壳聚糖-三聚磷酸钠纳米粒(cs-nps)，并用ha包覆cs-nps(ha-cs-nps)，使其纳米颗粒分散性能更好，改善了其粘附性。在体外释放研究中，被cs-nps和ha内外双层包覆的dex快速释放阶段持续了长达2小时，在这个快速阶段，大约40-50％的dex和大约35％的dex分别从cs-nps和ha-cs-nps中释放出来，此外，在12h内cs-nps和ha-cs-nps均释放超过75％的dex；在另一项研究中，lisna meylina等人制备了一种透明质酸包被的负载α-芒果苷(am)的壳聚糖纳米颗粒(am-cs/ha)。am从am-cs和am-cs/ha中的释放在最初的1小时内分别突释11％和8％，随后持续释放96h，表现出一定的缓释效果，最终am-cs和am-cs/ha释放的am总量大约分别为66％和60％。因此，即使使用ha对cs-nps进行涂覆，可以延缓药物的释放，但是不能解决初始阶段药物的突释以及后续阶段药物的长效缓控释问题。另外，faribanokhodi等人合成了一种负载他莫昔芬(tmx)的透明质酸包覆的壳聚糖纳米颗粒(ha-cs-nps)的靶向给药系统。在48小时内，cs-nps和ha-cs-nps在pbs中的tmx释放率分别大约40％和20％，与cs-nps相比，在ha-cs-nps中的tmx释放率延缓了大约50％。此外，与cs-nps相比，5天内ha-cs-nps在pbs中的tmx释放率大约低15％。虽然这些体系在一定程度上做到了药物持续释放，但是任何一种措施都没能实现包覆其中的一种药物和另一种药物序贯释放时间间隔达到24-48小时，即当其中一种药物持续释放的过程中，另一种药物在最初的24-48小时内完全没有释放。而且整体上这些载药体系缓控释时长明显不足。
6、中国专利cn115400071a和cn108434093a公开了关于非水溶性眼内药物控释的可注射水凝胶及其制备方法，仅仅将非水溶性药物伏立康唑负载到醛基化或线性环糊精的分子笼中，并未涉及其它纳米颗粒对于第二药物的负载以及序贯释药技术；中国专利cn117582546a、cn106117547b和cn114601958b均只涉及药物载体可注射水凝胶技术，并未体现双药物负载纳米复合可注射水凝胶和序贯药物长效控释的相关技术。因此，针对现有技术存在的问题：一方面没有合适的结构设计使得某一药物在体系中的初期释放量为零，而在24-48小时后开始释放；另一方面药物载体水凝胶虽然也能实现一定程度的缓释，但初期突释现象严重且缓释时间短。需要进一步发明一种序贯药物控释可注射水凝胶载体技术实现这类疾病治疗方案所要求的时空特异性、更优的药物控释性能和更长的药物控释时间，满足临床需求。
技术实现思路
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技术实现要素：
1、本发明的目的是针对现有技术双药物序贯释药无法实现，突释无法克服以及控释时间短的问题，提供一种序贯控释双药物负载可注射水凝胶及其制备方法和应用，将载有第一药物的交联γ-环糊精金属有机框架和从内到外依次用透明质酸和聚乙烯吡咯烷酮包覆的载有第二药物的壳聚糖纳米颗粒分散到载有第一药物的醛基化β-环糊精的pbs缓冲溶液中，形成第一分散液；将氨基化透明质酸分散到pbs缓冲溶液中形成第二分散液；然后将第一分散液和第二分散液等体积混合，通过席夫碱反应制备得到序贯控释双药物负载可注射水凝胶，能够实现两种药物的间隔序贯释放、第一药物的准零级控释以及整体双药物的长效控释。
2、为了实现上述目的，本发明提供一种序贯控释双药物负载可注射水凝胶的制备方法，将载有第一药物的交联γ-环糊精金属有机框架和从内到外依次用透明质酸和聚乙烯吡咯烷酮包覆的载有第二药物的壳聚糖纳米颗粒分散到载有第一药物的醛基化β-环糊精的pbs缓冲溶液中，形成第一分散液；将氨基化透明质酸分散到pbs缓冲溶液中形成第二分散液；然后将第一分散液和第二分散液等体积混合，通过席夫碱反应制备得到序贯控释双药物负载可注射水凝胶，具体包括以下步骤：
3、步骤一、制备载有第一药物的交联γ-环糊精金属有机框架纳米颗粒(gcv-cl-mof)，具体步骤如下：
4、(1)制备γ-cd-mof纳米颗粒：将γ-环糊精和氢氧化钾(koh)溶解到去离子水中，超声，用滤膜过滤除掉不溶物，随后加入甲醇，混合均匀后在50℃的恒温水浴中加热搅拌直至液体从浑浊变为澄清；然后，快速添加聚乙二醇20000和甲醇并在冷水中引发结晶材料的沉淀后，离心，洗涤，干燥，将固体颗粒在二氯甲烷(dcm)中浸泡三天，再离心分离，真空干燥至恒重，制得γ-环糊精金属有机框架纳米颗粒(γ-cd-mof)；
5、(2)制备交联γ-cd-mof(cl-mof)：将γ-cd-mof与碳酸二苯酯(dpc)一起加入到二甲基甲酰胺(dmf)和三乙醇胺(tea)的混合溶液中，60-100℃恒温下搅拌反应30-60h后，冷却至室温，加入乙醇猝灭反应，洗涤，真空干燥至恒重得到cl-mof；
6、(3)制备负载第一药物的交联γ-cd-mof:将第一药物和cl-mof混合在乙醇中，在恒温水浴磁力搅拌10-40h，离心分离，洗涤，除去未负载的第一药物，沉淀物真空干燥至恒重，得到载有第一药物的交联γ-cd-mof(gcv-cl-mof)，所述第一药物、交联γ-环糊精金属有机框架和乙醇的质量体积比为10-15mg：50mg：10ml；
7、步骤二、制备载有第一药物的醛基化β-环糊精溶液
8、将β-环糊精加入到去离子水中，加热搅拌溶解，冷却至室温，然后加入高碘酸钠(naio4)进行避光搅拌1-5h，再加入乙二醇继续搅拌0.5-4h，产物用透析袋(mw 500)和去离子水透析1-2天，冷冻干燥，制得醛基化β-环糊精(acd)；
9、将acd溶解在pbs溶液中以获得40mg/ml的acd溶液，然后通过超声分散法将第一药物分散到acd中的环糊精分子笼内，得到载有第一药物的acd溶液，溶液中醛基化β-环糊精的浓度为40mg/ml，第一药物的浓度为0-0.6mg/ml；
10、步骤三、制备从内到外依次用透明质酸和聚乙烯吡咯烷酮包覆的载有第二药物的壳聚糖纳米颗粒，具体步骤如下：
11、(1)制备载有第二药物的壳聚糖纳米颗粒(cs-nps)：将壳聚糖溶解在乙酸水溶液中以获得浓度为0.6mg/ml的壳聚糖乙酸溶液，然后将第二药物添加到上述壳聚糖乙酸溶液中；再将ph为7.4的三聚磷酸钠溶液在室温下以1.5ml·min-1的速率添加到上述含第二药物的壳聚糖乙酸溶液中，搅拌0.5-4h；冷冻干燥，制得载有第二药物的壳聚糖纳米颗粒；
12、(2)制备包覆透明质酸(ha)的负载第二药物的cs-nps：将步骤(1)制备好的负载第二药物的壳聚糖纳米颗粒分散在乙酸缓冲液中；然后，加入含有透明质酸的乙酸缓冲液，搅拌20-60min，冷冻干燥，得到ha包覆的载有第二药物的壳聚糖纳米颗粒；
13、(3)制备涂覆聚乙烯基吡咯烷酮(pvp)的透明质酸包覆的负载第二药物的cs-nps：将步骤(2)制备好的透明质酸包覆的负载第二药物的壳聚糖纳米颗粒分散在乙酸缓冲液中；然后，加入含浓度为0.5mg/ml pvp的乙酸缓冲液，搅拌20-60min，冷冻干燥，得到从内到外依次用透明质酸和聚乙烯吡咯烷酮包覆的载有第二药物的壳聚糖纳米颗粒(phdcnps)；
14、步骤四、制备序贯控释双药物负载可注射水凝胶，具体步骤如下：
15、(1)制备第一分散液：将步骤一制备的载有第一药物的交联γ-环糊精金属有机框架纳米颗粒和步骤三制备的从内到外依次用透明质酸和聚乙烯吡咯烷酮包覆的载有第二药物的壳聚糖纳米颗粒共同分散到步骤二制备的载有第一药物的醛基化β-环糊精溶液中，得到第一分散液；
16、(2)制备第二分散液：先制备氨基化透明质酸(nha)，取ha溶于蒸馏水中，全溶后，加入盐酸乙二胺和4-二甲氨基吡啶(damp)(催化剂)混合均匀；混匀后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(edc)和n-羟基丁二酰亚胺(nhs)，然后加入naoh溶液调至ph范围在4.5-5.5，继续搅拌反应2天，期间维持ph范围在4.5-5.5，2天后用naoh溶液调至ph＝7停止反应；然后用透析袋(mw 14000)和蒸馏水透析3-5天，然后将其取出并冷冻干燥，冻干后的固体即为nha；将nha加入到pbs溶液中配置nha浓度为50mg/ml的第二分散液；
17、(3)制备序贯控释双药物负载可注射水凝胶：将第一分散液和第二分散液混合均匀，通过醛基和氨基之间的席夫碱反应进行交联，制得序贯控释双药物负载可注射水凝胶。
18、本发明所述第一药物为非水溶性药物，第二药物为水溶性药物。
19、本发明所述第一药物为更昔洛韦，第二药物为地塞米松磷酸钠。本发明所述磷酸盐缓冲液pbs的浓度为0.01m，ph为7.4。
20、本发明所述乙酸缓冲液的浓度为0.1m，ph为5.0。
21、本发明所述步骤一(2)中乙醇加入量为反应液体积的2倍。
22、本发明所述步骤一(3)中负载第一药物的交联γ-cd-mof(gcv-cl-mof)的载药率(以质量计)为18.4±0.6％，可根据水凝胶体系中所需药物浓度，通过计算适量添加gcv-cl-mof。
23、本发明所述第一分散液每100.0ml含有326.0mg～652.0mg载有第一药物的交联γ-环糊精金属有机框架纳米颗粒和464.0mg从内到外依次用透明质酸和聚乙烯吡咯烷酮包覆的的载有第二药物的壳聚糖纳米颗粒。
24、本发明所述步骤二中醛基化β-环糊精(acd)的载药率(以质量计)为9.56±0.29％，作为具有双重功效既可以负载药物又充当交联剂的acd而言，水凝胶体系中加入的acd的量主要取决于水凝胶主体的制备，如所加药物通过acd中环糊精分子笼不能完全负载，那么，多出的药物会直接分散到水凝胶主体包含的水中。
25、本发明所述步骤一和步骤二中将第一药物负载到cl-mof和acd中，均是利用两种纳米结构的微纳孔隙的吸附作用和一定的氢键相互作用力，并且通过降解过程中两种结构的次第破坏实现第一药物的缓控释。
26、本发明所述步骤三中的制备原理包括通过三聚磷酸钠与壳聚糖之间的离子交联反应形成壳聚糖纳米颗粒；透明质酸的分子链上面带负电荷，壳聚糖分子链上的氨基带正电荷，二者之间形成电荷相互作用力，从而形成对纳米壳聚糖颗粒的包覆；pvp具有良好的成膜能力及生物相容性，而且ha和pvp分子中的氧的孤对电子和相邻的氢原子之间可以形成氢键作用，因此pvp能够对透明质酸包覆的壳聚糖纳米颗粒进行再次包覆，通过双层包覆实现第二药物与第一药物的之间间隔24h的序贯释放以及24h后两种药物的缓控释。
27、本发明所述步骤三中载有第二药物的壳聚糖纳米颗粒载药率为19.01±0.95％，从内到外依次用透明质酸和聚乙烯吡咯烷酮包覆的载有第二药物的壳聚糖纳米颗粒(phdcnps)的载药率17.28±0.51％，可根据水凝胶体系中所需药物浓度，通过计算适量添加phdcnps。
28、本发明所述步骤四中透明质酸(ha)的分子量为10-20万，盐酸乙二胺的加入量为ha重复单元摩尔数的50倍，4-二甲氨基吡啶(damp)的加入量为ha重复单元摩尔数的30倍，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(edc)和n-羟基丁二酰亚胺(nhs)的加入量为ha重复单元摩尔数的25倍。
29、本发明所述步骤四中第一分散液和第二分散液的混合体积比为1：1。
30、本发明还提供利用上述制备方法制得的序贯控释双药物负载可注射水凝胶，实现了第一药物和第二药物的序贯释放，第一药物能够零级释放，第二药物在第一药物释放24h后开始释放，两种药物缓控释时长大于20天。
31、本发明还提供所述序贯控释双药物负载可注射水凝胶在制备治疗急性视网膜坏死药物中的应用，所述第一药物为更昔洛韦，第二药物为地塞米松磷酸钠，更昔洛韦能够零级释放，突释现象不明显，地塞米松磷酸钠在更昔洛韦释放24h后开始释放，药物控释时长大于20天。
32、本发明所述第一药物为更昔洛韦，第二药物为地塞米松磷酸钠时，利用本发明制备方法制得的序贯控释双药物负载可注射水凝胶能够作为治疗急性视网膜坏死的药物。利用本发明制备方法，能够根据实际情况选择第一药物和第二药物的具体成分，用于制备治疗其他疾病药物，实现双药物序贯控释。
33、本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
34、(1)本发明制得的序贯控释双药物负载可注射水凝胶，实现了第一药物和第二药物在24h-48h之内的时间间隔的序贯药物控释，而且在前24h没有第二药物释放出来。
35、(2)本发明制得的序贯控释双药物负载可注射水凝胶克服了第一药物的初期药物突释现象，实现了第一药物的准零级释放。
36、(3)本发明制得的序贯控释双药物负载可注射水凝胶实现了双药物序贯释放长效控释>20天。
37、综上，本发明序贯控释双药物负载可注射水凝胶的制备方法原理科学，操作简单，成本低，适用药物广泛；作为一种可注射药物技术，在制备任何需要控制不同药物时空特异性释放的药物载体中都有很大的应用潜力，适于大规模推广。
1.一种序贯控释双药物负载可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将载有第一药物的交联γ-环糊精金属有机框架和从内到外依次用透明质酸和聚乙烯吡咯烷酮包覆的载有第二药物的壳聚糖纳米颗粒分散到载有第一药物的醛基化β-环糊精溶液中，形成第一分散液；将氨基化透明质酸分散到pbs缓冲溶液中形成第二分散液；然后将第一分散液和第二分散液混合，通过席夫碱反应制备得到序贯控释双药物负载可注射水凝胶。
2.根据权利要求1所述序贯控释双药物负载可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，所述载有第一药物的交联γ-环糊精金属有机框架的制备方法为：将γ-环糊精金属有机框架材料与碳酸二苯酯一起加入到二甲基甲酰胺和三乙醇胺的混合溶液中，60-100℃恒温下搅拌反应30-60h，然后冷却至室温，洗涤沉淀，真空干燥，制得交联γ-环糊精金属有机框架材料；再将第一药物和交联γ-环糊精金属有机框架分散到乙醇中，搅拌10-40h，离心，洗涤，干燥，制得载有第一药物的交联γ-环糊精金属有机框架材料。
3.根据权利要求1所述序贯控释双药物负载可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，所述载有第一药物的醛基化β-环糊精溶液的制备方法为：将醛基化β-环糊精溶解在pbs溶液中配置醛基化β-环糊精溶液，将第一药物分散到醛基化β-环糊精溶液，制得载有第一药物的醛基化β-环糊精溶液。
4.根据权利要求1所述序贯控释双药物负载可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，所述从内到外依次用透明质酸和聚乙烯吡咯烷酮包覆的载有第二药物的壳聚糖纳米颗粒的制备方法为：将壳聚糖溶解在乙酸水溶液中以获得壳聚糖乙酸溶液，然后将第二药物添加到壳聚糖乙酸溶液中，再加入三聚磷酸钠溶液，搅拌，冷冻干燥，制备得到载有第二药物的壳聚糖纳米颗粒；将上述产物分散在乙酸缓冲液中，再加入含有透明质酸的乙酸缓冲液，搅拌，冷冻干燥，得到透明质酸包覆的壳聚糖纳米颗粒；接着将透明质酸包覆的壳聚糖纳米颗粒分散在乙酸缓冲液中，然后加入含有聚乙烯吡咯烷酮的乙酸缓冲液，搅拌，冷冻干燥，制得从内到外依次用透明质酸和聚乙烯基吡咯烷酮包覆的载有第二药物的壳聚糖纳米颗粒。
5.根据权利要求1所述序贯控释双药物负载可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，所述载有第一药物的醛基化β-环糊精溶液中，醛基化β-环糊精的浓度为40mg/ml；所述第二分散液中氨基化透明质酸的浓度为50mg/ml。
6.根据权利要求1所述序贯控释双药物负载可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，第一分散液和第二分散液的体积比为1：1。
7.根据权利要求1所述序贯控释双药物负载可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，所述第一药物为非水溶性药物，第二药物为水溶性药物。
8.根据权利要求4所述序贯控释双药物负载可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，的三聚磷酸钠溶液的ph为7.4，在室温下以1.5ml·min-1的速率添加到壳聚糖乙酸溶液中。
9.利用权利要求1-8任一项所述制备方法得到的序贯控释双药物负载可注射水凝胶。
10.权利要求9所述序贯控释双药物负载可注射水凝胶在制备治疗急性视网膜坏死药物中的应用，所述第一药物为更昔洛韦，第二药物为地塞米松磷酸钠，更昔洛韦能够零级释放，地塞米松磷酸钠在第一药物释放24后开始释放，药物控释时长大于20天。
