本技术属于碳点纳米酶，更具体地，涉及碳点纳米酶及负载碳点纳米酶的水凝胶及其在检测产品新鲜度中的应用。
背景技术：
1、水产品在腐败阶段，体内含氮物质分解为碱性胺类物质，使ph值不断上升。ph作为评价水产品新鲜度的重要指标之一，目前通常使用酸度计法、近红外光谱、探针式ph计、比色阵列传感器等测定水产品的ph，这些方法常常需要对实际样品进行粉碎、离心等前处理，步骤繁琐效率低下，处理长，容易导致胺类物质挥发影响结果准确性，难以实现水产品新鲜度的大规模检测和长期监测。智能指示标签作为目前实现可视化监测水产品新鲜度的高效无损检测技术，通常是依赖比色通道或者荧光通道检测ph的变化，对于色盲人群和对颜色不敏感的人群来说存在判断困难。
2、次黄嘌呤(hx)是水产品腐败初期广泛出现的物质之一，在水产品死亡后逐步积累，是近年来评价水产品新鲜度最热门的指标之一。目前通常使用质谱学技术、近红外光谱、电子鼻、电子舌技术、计算机视觉技术和气相色谱-质谱仪(gc-ms)技术等检测hx，检测结果准确可靠，但检测步骤繁琐且对设备要求较高，难以快速进行大规模检测。基于酶联反应建立比色法或荧光分析法实现hx的可视化检测是一种灵敏可行的策略，但这种策略需要黄嘌呤氧化酶(xod)先将hx氧化分解为h2o2，再利用纳米材料的过氧化物酶(pod)性质将h2o2氧化为活性氧与显色底物作用。其中生物酶价格昂贵且不稳定，且涉及到两种酶催化反应耗时较长，对检测条件要求仍比较苛刻。基于hx直接反向调节纳米酶活性的检测手段的出现，为hx的快速精准检测提供了新的策略。研究发现hx可以显著减弱立方铂纳米材料(pvp-ptnc)的pod活性，强有力抑制了蓝色产物ox-tmb的生成，可以在不使用天然酶(xod)的情况下实现hx的定量检测，突破了依赖氧化酶二次转化hx的局限性。
3、水产品具有极高营养价值，是优质蛋白的重要来源，但水产品中含有大量水分和活跃的内源性蛋白酶，死亡后极易腐败，导致ph和hx发生显著变化，ph和hx作为评价水产品新鲜度的重要指标，但目前的技术一般是单独检测ph或hx指标，无法同时检测ph和hx指标，单个指标检测容易受环境干扰使检测结果不够准确，多指标检测能最大程度保证检测的准确性，因此开发一种高效灵敏、能够同时快速捕捉水产品中ph和hx双重指标的变化的检测技术，在水产品安全检测领域具有巨大的应用价值。
技术实现思路
1、针对现有技术的缺陷，本技术的目的在于提供了碳点纳米酶及负载碳点纳米酶的水凝胶及其在检测产品新鲜度中的应用，旨在解决现有技术检测ph、hx指标的步骤繁琐、检测结果准确度低，难以快速进行大规模检测，以及无法同时检测ph和hx指标等技术问题。
2、为实现上述目的，本技术提供了一种碳点纳米酶的制备方法，包括如下步骤：
3、将乙二胺四乙酸二钠盐、2,4-二羟基苯甲酸、铁源、钴源、磷源和水混合均匀，加热进行合成反应，反应液经离心、透析、冷冻干燥，得到碳点纳米酶。
4、优选地，上述铁源为六水合氯化铁、硫酸铁和硝酸铁中的一种或多种。
5、优选地，上述钴源为vb12、氯化钴、硫酸钴和硝酸钴中的一种或多种。
6、优选地，上述磷源为磷酸、磷酸二氢钠和焦磷酸钠中的一种或多种。
7、优选地，上述乙二胺四乙酸二钠盐、2,4-二羟基苯甲酸、铁源、钴源和磷源的质量比为(0.05～0.1)：(0.05～0.1)：(0.01～0.05)：(0.01～0.05)：(8～10)。
8、优选地，上述反应液中，上述乙二胺四乙酸二钠盐的浓度为2mg/ml～4mg/ml。
9、优选地，上述合成反应的温度为180℃～220℃，合成反应的时间为1h～5h。
10、本技术还提供了一种根据上述制备方法制备得到的碳点纳米酶。
11、本技术还提供了上述碳点纳米酶在检测ph和/或次黄嘌呤中的应用。
12、另一方面，本技术提供了一种负载上述碳点纳米酶的水凝胶。
13、优选地，上述水凝胶的制备方法包括如下步骤：
14、将上述碳点纳米酶的水溶液和显色底物溶液、h2o2溶液、pbs缓冲溶液、海藻酸钠、明胶、壳聚糖混合均匀，得到蓝色聚合物溶液；然后将所述蓝色聚合物溶液和cacl2溶液混匀，静置交联，得到水凝胶。
15、优选地，上述水凝胶包括水凝胶薄膜、水凝胶球中的至少一种。
16、优选地，上述碳点纳米酶的水溶液中碳点纳米酶的浓度为10mg/ml～20mg/ml；和/或，
17、上述显色底物溶液中显色底物的浓度为5mm～20mm；和/或，
18、上述显色底物为3,3’,5,5’-四甲基联苯胺；和/或，
19、上述h2o2溶液中h2o2的质量百分数为0.3wt％～3wt％。
20、优选地，上述碳点纳米酶的水溶液、上述显色底物溶液和上述h2o2溶液的体积比为(0.5～1.5)：(4～6)：(0.5～1.5)。
21、优选地，上述pbs缓冲溶液的ph为3～5。
22、优选地，上述蓝色聚合物溶液中，上述海藻酸钠溶液的质量百分数为0.8wt％～1.5wt％；和/或，上述明胶的质量百分数为0.45wt％～1wt％；和/或，上述壳聚糖溶液的质量百分数为0.2wt％～0.42wt％。
23、进一步地，本技术还提供了上述水凝胶在可视化快速检测ph和/或次黄嘌呤以判别产品新鲜度中的应用。
24、总体而言，通过本技术所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的技术优点：
25、(1)本技术提供的碳点纳米酶的制备方法，以乙二胺四乙酸二钠盐、2,4-二羟基苯甲酸、铁源、钴源、磷源为原料，加热进行合成反应，制备得到绿色发光的铁钴磷共掺杂的碳点纳米酶(fe,co,p-cds纳米酶)，工艺简单且易于实现，制备得到的碳点纳米酶的量子产率高，其荧光颜色和荧光强度对ph敏感，且具有优异的过氧化物酶模拟活性，能够用于检测ph和hx。进一步地，基于fe,co,p-cds纳米酶构建ph和次黄嘌呤检测传感平台，能够用于监测水产品的新鲜度。
26、(2)相较于p-cds纳米酶、fe,p-cds纳米酶和co,p-cds纳米酶，本技术提供的fe,co,p-cds纳米酶具有优异的过氧化物酶模拟活性，甚至优于fe,p-cds纳米酶和co,p-cds纳米酶的技术效果的简单加和。
27、(3)本技术提供的负载上述fe,co,p-cds纳米酶的水凝胶，将安全可靠且具有巨大检测潜力的fe,co,p-cds纳米酶与智能响应性凝胶结合，制备得到具有ph和hx双重响应性的一体化便携智能水凝胶，能够实现可视化监测食品的新鲜度，尤其是水产品的新鲜度，为水产品新鲜度的检测提供新器件，在食品安全检测领域具有重大创新和应用价值。
28、(4)优选实施例中，本技术提供的水凝胶薄膜具备优异的ph响应灵敏度，在ph小于8时，能够保持形态稳定，在ph为8时，能够由固态转变为溶胶态，无需负载其他活性材料，仅通过肉眼观察到的形态变化即可快速捕捉ph信号，突破了智能标签指示食品新鲜度只能依赖于颜色和荧光变化的局限性，为大众快速判断食品新鲜度提供了新角度。上述水凝胶薄膜还具备优异的hx响应性，在水产品腐败变质时出现破碎溶化和蓝色完全褪色两种肉眼可见的明显变化，能够通过形态和颜色变化准确评价水产品的新鲜度，快速实现水产品新鲜度的裸眼可视化在线监测。此外，上述水凝胶还具有优异的稳定性、生物相容性和便携性，安全可靠，能适用于多种场景。
1.一种碳点纳米酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述铁源为六水合氯化铁、硫酸铁和硝酸铁中的一种或多种；所述钴源为vb12、氯化钴、硫酸钴和硝酸钴中的一种或多种；所述磷源为磷酸、磷酸二氢钠和焦磷酸钠中的一种或多种；
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述合成反应的温度为180℃～220℃，合成反应的时间为1h～5h。
4.一种根据权利要求1至3任一项所述的制备方法制备得到的碳点纳米酶。
5.权利要求4所述的碳点纳米酶在检测ph和/或次黄嘌呤中的应用。
6.一种负载权利要求4所述的碳点纳米酶的水凝胶。
7.根据权利要求6所述的水凝胶，其特征在于，所述水凝胶的制备方法包括如下步骤：
8.根据权利要求7所述的水凝胶，其特征在于，所述碳点纳米酶的水溶液中碳点纳米酶的浓度为10mg/ml～20mg/ml；和/或，
9.根据权利要求7所述的水凝胶，其特征在于，所述蓝色聚合物溶液中，所述海藻酸钠溶液的质量百分数为0.8wt％～1.5wt％；和/或，所述明胶的质量百分数为0.45wt％～1wt％；和/或，所述壳聚糖溶液的质量百分数为0.2wt％～0.42wt％。
10.根据权利要求6至9任一项所述的水凝胶在可视化快速检测ph和/或次黄嘌呤以判别产品新鲜度中的应用。
