本发明涉及微生物发酵技术应用领域，具体涉及一种黑茶饮料的发酵制备方法。
背景技术：
1、黑茶是一种我国独有的后发酵茶，因其各种健康益处和独特的感官特征而得到广泛关注。黑茶的内含成分相较于红茶和绿茶有极大差异，所表现的功能活性也不同。黑茶具有清热、消暑、解毒、消食、解腻、利尿、通便、止咳生津、提神、化痰等功效，一直被誉为一种攻补兼备的良药。黑茶中含咖啡碱、维生素、氨基酸、磷脂等活性物质，有助于人体消化、调节脂肪代谢，具有极强的解腻、消食等作用。其中，咖啡碱的刺激作用能提高胃液的分泌量，从而增进食欲、促进消化。同时，黑茶中含量丰富的茶多糖具有降低血脂和血液中过氧化物活性的作用，此外，黑茶中含量丰富的类黄酮等具有清除自由基的功能，因而黑茶具有抗氧化、延缓细胞衰老的作用。然而，传统黑茶是通过固态发酵(ssf)生产，固态发酵具有如发酵时间长、质量不稳定、易受微生物污染等缺点。与固态发酵相比，液态发酵(lsf)具有显著优势，如发酵时间短、微生物污染少、易于实现大规模自动化生产等。lsf已成为发酵饮料生产的主要方法。冠突散囊菌(eurotium cristatum)是茯砖茶生产加工过程中的优势微生物，是茯砖茶品质形成的主要生化动力来源。已有研究证实，冠突散囊菌在形成茯砖茶独特香气特征方面发挥了关键作用，有利于改善茶的品质特征。利用e.cristatum进行液态发酵可用于发酵茶饮料的高效工业化生产，其具有培养周期短、产量高、易于标准化等优点，从而有利于将低等级茶叶转化为高附加值饮料。
2、水开菲尔(water kefir)因其富含多种益生菌而广受消费者青睐。水开菲尔粒是由乳酸菌、酵母菌和醋酸菌等共生微生物组成的复合菌群，可为人体肠道提供丰富益生菌，能维持肠道菌群的平衡，有助于预防消化不良、肠应激综合症、高血压、高血脂等多种疾病，对于无法饮用酸奶的素食主义者来说其是摄入益生菌的良好来源。水开菲尔的诸多优点有助于具有益生菌功效的新型饮料的生产。利用水开菲尔发酵黑茶茶汤并添加冠突散囊菌与其共发酵，可实现微生物对茶资源的综合开发利用，有利于提高黑茶产品的多样性。利用微生物发酵将茶叶加工成茶饮料，能够进一步提高茶资源的利用率和茶叶的附加值，为茶农提高经济效益，具有重要的实践价值。水开菲尔复合菌群发酵黑茶饮料将是一款具有独特风味的新型益生菌饮料，极具市场前景。
技术实现思路
1、本发明的目的在于丰富黑茶饮料的种类，解决传统水开菲尔饮料生产难以实现工业化的问题，利用水开菲尔发酵黑茶茶汤并添加冠突散囊菌与其共发酵，实现微生物综合开发利用茶资源与黑茶产品的多样性。提供一种低成本、高质量的水开菲尔复合菌群发酵黑茶饮料的制作方法及其应用。
2、为达到上述目的，本发明采取了以下技术方案：
3、本发明涉及的冠突散囊菌(eurotium cristatum)sc-1，保藏日期为2023年3月23日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctcc no:m2023397，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。其its-2序列如seq id no:1-2所述：
4、its1
5、gtggcttcgagtgcgggactctgggtccacctcccatccgtgtctatctgtaccctgttgcttcggcgtggccacggcccgccggagactaacatttgaacgctgtctgaagtttgcagtctgagtttttagttaaacaatcgttaaaactttcaacaacggatctcttggttccggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataattaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgagtctttgaacgcacattgcgccccctggtattccggggggcatgcctgtccgagcgtcattgctgccctcaagcacggcttgtgtgttgggcttccgtccctggcaacggggacgggcccaaaaggcagtggcggcaccatgtctggtcctcgagcgtatggggctttgtcacccgctcccgtaggtccagctggcagctagcctcgcaaccaatctttttaaccaggttgacctcggatcaggtagggatacccgctgaacttaagcatatcaaaagccggag
6、its4
7、tattgggcatctacctgatccgaggtcaacctggttaaaaagattggttgcgaggctagctgccagctggacctacgggagcgggtgacaaagccccatacgctcgaggaccagacatggtgccgccactgccttttgggcccgtccccgttgccagggacggaagcccaacacacaagccgtgcttgagggcagcaatgacgctcggacaggcatgccccccggaataccagggggcgcaatgtgcgttcaaagactcgatgattcactgaattctgcaattcacattaattatcgcatttcgctgcgttcttcatcgatgccggaaccaagagatccgttgttgaaagttttaacgattgtttaactaaaaactcagactgcaaacttcagacagcgttcaaatgttagtctccggcgggccgtggccacgccgaagcaacagggtacagatagacacggatgggaggttggacccagagggcccgcactcggtaatgatccttccgcaggccccctatggggag
8、首先，本发明提供一种含有冠突散囊菌(eurotium cristatum)的发酵剂的制备方法，该方法包括以下步骤：
9、(1)将冠突散囊菌(eurotium cristatum)在无菌的条件下接入m40y培养基中进行传代活化；
10、(2)将传代活化后的冠突散囊菌(eurotium cristatum)sc-1在无菌条件下转接至m40y固体培养基，在28℃的条件下培养7d，待培养基中长出大量冠突散囊菌(eurotiumcristatum)sc-1菌体及金黄色孢子；
11、(3)在无菌的条件下，取所述金黄色孢子及菌丝接种于m40y固体培养基，28℃培养7d，得到活化好的冠突散囊菌(eurotium cristatum)sc-1或发酵菌剂；
12、(4)将活化好的冠突散囊菌(eurotium cristatum)sc-1或发酵菌剂，用无菌水将孢子洗下，分散均匀，得到活化好的冠突散囊菌(eurotium cristatum)sc-1或发酵菌剂的孢子，备用。
13、同时，本发明还提供一种水开菲尔发酵剂的制备方法，该方法包括以下步骤：
14、(1)水开菲尔粒在发酵前置于红糖水(100g/l)中保持其活性。红糖水预先在121℃下灭菌20min。
15、(2)先将水开菲尔粒按12％(w/v)比例接种于红糖水中，置于玻璃瓶中培养，瓶口覆盖纱布，28℃下培养24h。
16、(3)发酵结束后，用无菌筛滤出水开菲尔粒，所得滤液即为本研究所需的水开菲尔发酵剂。滤出的水开菲尔粒则继续保存在红糖水中。
17、最后，本发明还提供一种所述水开菲尔复合菌群发酵黑茶饮料的制备方法，该方法包括以下步骤：
18、(1)黑毛茶粉碎过40目筛后按1:50的茶水比(g/ml)在90℃下水浴浸提45min。所得黑毛茶茶汤用纱布过滤后在4000r/min条件下离心10min，以除去茶汤中的细小茶渣。
19、(2)分别取140ml黑毛茶茶汤分装至250ml的锥形瓶中，分装好后将样品进行高温高压灭菌。
20、(3)待温度降至室温后(25℃)，将冠突散囊菌(eurotium cristatum)sc-1发酵剂、水开菲尔发酵剂接种于黑茶茶汤上进行发酵；
21、(4)以未发酵的黑茶茶汤(第0天)作为对照。收集到的黑茶茶汤样品储存在-20℃的冰箱中。
22、在制备方法中，优选地，步骤(1)中，所得黑毛茶茶汤用纱布过滤后在4000r/min条件下离心10min，以除去茶汤中的细小茶渣。
23、在制备方法中，优选地，步骤(2)中，所述高温高压灭菌的具体条件为：121℃下灭菌20min。
24、在制备方法中，优选地，步骤(3)中，接种比例为7ml(5％，v/v)水开菲尔和2.8ml(2％，v/v)冠突散囊菌发酵剂接种于黑毛茶茶汤中进行发酵。冠突散囊菌(eurotiumcristatum)sc-1发酵剂中冠突散囊菌(eurotium cristatum)sc-1的孢子浓度为106～107个/ml，所述发酵的具体条件为28℃、120r/min的振荡培养箱中培养8天。
25、本发明发现，水开菲尔与冠突散囊菌共发酵黑茶饮料显著改善了黑茶茶汤的感官特征，增强了黑茶茶汤的菌花香和薄荷香强度，降低了茶汤的苦味、涩味，提高了茶汤的醇厚感和鲜味，具有优良的感官特性。同时，在黑茶茶汤发酵过程中共鉴定出65种挥发性有机化合物。共发酵茶汤显著提高了芳樟醇及其氧化物、α-松油醇、水杨酸甲酯、甲基庚烯酮、苯乙酮、4-乙基-1,2-二甲氧基苯、3,4-二甲氧基苯乙烯等宜人风味的含量，显著降低了2-甲基丁酸、3-甲基丁酸、乙酸等不良刺激性气味的含量。相较于单独发酵组而言，共发酵组具有更佳的风味。研究发现共发酵显著影响了发酵黑茶茶汤的微生物群落组成，提高了黑茶茶汤中liquorilactobacillus、lacticaseibacillus和acetobacter的相对丰度，降低了gluconobacter和saccharomyces的相对丰度。此外，水开菲尔的添加显著提高了黑茶茶汤中琥珀酸的含量，乳酸含量在共发酵组中显著增加。冠突散囊菌发酵显著降低了茶汤中的酯型儿茶素含量和总儿茶素含量。水开菲尔的添加能有效抑制酯型儿茶素egcg、ecg和gcg的降解，抑制非酯型儿茶素进一步的降解转化，积累茶汤中的非酯型儿茶素gc，保持发酵茶汤中较高的非酯型儿茶素含量和总儿茶素含量，对提高发酵黑茶茶汤的抗氧化活性有重要意义。综上，本发明有助于具有独特风味和良好抗氧化活性的新型发酵黑茶饮料的开发利用，在茶饮料行业具有巨大应用潜力。
26、与现有技术相比，本发明的优点在于：
27、(1)本发明采用的冠突散囊菌来源于传统茯砖茶，水开菲尔具有天然绿色的特点，更容易获得现代消费者的认可。此外，液体发酵工艺条件易于控制，操作简单，制备过程节能环保、无废水废气废料产生，易于实现大规模的生产。
28、(2)本发明制备的发酵黑茶增强了茶汤的菌花香和薄荷香强度，降低了茶汤的苦味、涩味，提高了茶汤的醇厚感和鲜味，具有优良的感官特性。除了能改善黑茶的风味特征，赋予食品独特的色、香、味外，还能提高其生物功能活性。
29、(3)将本发明的冠突散囊菌、水开菲尔混合菌群协调发酵方法应用于黑茶饮料等发酵食品的生产中，有助于降低生产成本、提高发酵黑茶制品的质量和品质。
1.一种基于水开菲尔和冠突散囊菌混合发酵黑茶饮料的发酵制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的发酵制备方法，其特征在于，所述冠突散囊菌(eurotiumcristatum)sc-1发酵剂的制备方法包括以下步骤：
3.根据权利要求1所述的发酵制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述水开菲尔发酵剂的制备方法包括以下步骤：
4.根据权利要求1所述的发酵制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述除杂黑毛茶茶汤用纱布过滤后在4000r/min条件下离心10min，以除去茶汤中的细小茶渣。
5.根据权利要求1所述的发酵制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述过筛为过40目筛。
6.根据权利要求1所述的发酵制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述高温高压灭菌后冷却的具体条件为：121℃下灭菌20min后冷却至25℃。
7.根据权利要求1所述的发酵制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述水开菲尔发酵剂的接种量为5％和所述冠突散囊菌(eurotium cristatum)sc-1发酵剂接种量为2％，所述冠突散囊菌(eurotium cristatum)sc-1发酵剂的孢子浓度106～107个/ml，所述发酵的具体条件为28℃、120r/min的振荡培养箱中培养8天。
8.一种由权利要求1-7任一所述的制备方法制备得到的水开菲尔复合菌群发酵黑茶饮料。
