本公开涉及用于产生产物，例如重组蛋白的细胞和细胞系，例如真核细胞和细胞系。本公开还涉及调节蛋白质降解途径以实现产物，例如重组蛋白质的改善的生产。
背景技术：
1、高度产生重组cho细胞系的产生和选择已经强调为细胞系开发过程中的瓶颈。因此，需要鉴定和产生具有高度产生重组蛋白的能力的细胞系的方法。
技术实现思路
1、本公开内容部分基于以下发现：细胞，例如真核细胞，例如真核细胞，例如哺乳动物或哺乳动物细胞以外的细胞产生产物，例如重组多肽的能力和对蛋白质降解途径抑制剂，例如蛋白酶体抑制剂、泛素途径抑制剂和erad抑制剂的易感性之间的相关性。不希望受理论束缚，据信蛋白质降解途径抑制剂可用于选择高度生产率细胞，例如能够产生产物，例如重组多肽的高产率的细胞。因此，本文公开了用于评估、选择、分类或鉴定用于产生产物(例如重组多肽)的细胞的方法和过程。本文还提供了通过鉴定或选择能够有高生产率的细胞来生成用于产生产物(例如重组多肽)的细胞或细胞系的方法和方法。本文所述的这些方法和过程包括使细胞与蛋白质降解抑制剂接触，例如，抑制或降低蛋白质降解途径的活性。因此，本文不仅提供了用于鉴定更好质量的细胞，例如具有更高的生产率，用于生产产物，例如重组多肽的方法，而且还提供产生更好质量产物，例如重组多肽产物，例如，单克隆抗体和难以表达的蛋白质，例如双特异性分子的细胞。
2、在一方面，本公开内容的特征在于评估、分类、鉴定、生成或选择用于例如产生产物，例如多肽、重组多肽的细胞或后代细胞或后代细胞群体的方法。在一个实施方案中，所述方法包括：
3、a)任选地提供细胞；
4、b)使所述细胞(或所述细胞的后代)与蛋白质降解抑制剂，例如蛋白酶体抑制剂、泛素途径抑制剂、或内质网相关降解(erad)抑制剂接触；
5、c)评估蛋白质降解抑制剂，例如蛋白酶体抑制剂、泛素途径抑制剂或erad抑制剂对所述细胞(或所述细胞的后代)中与细胞功能相关的一个或多个参数的影响；
6、d)任选地将蛋白质降解抑制剂，例如蛋白酶体抑制剂对所述一个或多个参数的影响的值与参考值比较；并且
7、e)任选地从所述细胞(或所述细胞的后代)表达产物，例如重组多肽；并且
8、从而评估、分类、鉴定、生成或选择细胞或后代细胞或后代细胞群体。在一个实施方案中，该方法包括提供细胞。在一个实施方案中，该方法包括将蛋白质降解抑制剂(例如蛋白酶体抑制剂)对一种或多种参数的影响值与参考值比较。在一个实施方案中，该方法包括从细胞(或细胞的后代)表达产物，例如重组多肽。
9、由本文描述的细胞和方法产生的产物可以是分子、核酸、多肽或其任何融合物或杂合物。在一个实施方案中，产物是非天然存在的物质或分子。在另一个实施方案中，产物是天然存在的物质或分子。工程化改造或修饰产生本文所述的产物的细胞以控制，例如，增加表达，或产生，例如，编码本文所述的产物。在一个实施方案中，对细胞进行工程化改造或修饰以包含外源核酸，其控制例如增加内源表达产物的表达。在另一个实施方案中，对细胞进行工程化改造或修饰以包含编码产物，例如内源表达的产物、不由细胞内源产生的产物、或非天然存在的产物的外源核酸。
10、在一个实施方案中，评估、分类、鉴定、生成或选择用于例如产生产物，例如多肽、重组多肽的细胞或后代细胞或后代细胞群体的方法包括评估细胞或后代细胞或后代细胞群体。
11、在一个实施方案中，评估、分类、鉴定、生成或选择用于例如产生产物，例如多肽、重组多肽的细胞或后代细胞或后代细胞群体的方法包括分类细胞或后代细胞或后代细胞群体。
12、在一个实施方案中，评估、分类、鉴定、生成或选择用于例如产生产物，例如多肽、重组多肽的细胞或后代细胞或后代细胞群体的方法包括鉴定细胞或后代细胞或后代细胞群体。
13、在一个实施方案中，评估、分类、鉴定、生成或选择用于例如产生产物，例如多肽、重组多肽的细胞或后代细胞或后代细胞群体的方法包括生成细胞或后代细胞或后代细胞群体。
14、在一个实施方案中，评估、分类、鉴定、生成或选择用于例如产生产物，例如多肽、重组多肽的细胞或后代细胞或后代细胞群体的方法包括选择细胞或后代细胞或后代细胞群体。
15、在一个实施方案中，评估、分类、鉴定、生成或选择用于例如产生产物，例如多肽、重组多肽的细胞或后代细胞或后代细胞群体的方法还包括例如作为步骤(b)的一部分，培养与所述蛋白质降解抑制剂接触的所述细胞(或所述细胞的后代)。
16、本文的方法包括鉴定或选择具有改善的，例如增加的生产率的细胞，例如产生产物，例如多肽，例如重组多肽的能力。在一个实施方案中，与由尚未被蛋白质降解抑制剂接触的细胞产生的水平、量或数量相比，由鉴定或选择的细胞产生的产物的水平、量或数量增加例如1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍或100倍或更多。
17、本文描述的方法包括鉴定或选择具有改善的，例如增加的产物，例如重组多肽质量的细胞。在一个实施方案中，与由尚未被蛋白质降解抑制剂接触的细胞产生的产物的质量相比，由鉴定或选择的细胞产生的产物的质量增加例如1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍或100倍或更多。在一个实施方案中，产物质量的改善包括下列中的一种或多种：期望产物的水平、量或比例增加，例如，相对于不需要的同种型、片段化或截短形式；正确折叠产物的水平、量或比例增加；功能性，例如酶活性产物的水平、数目或比例增加；聚集产物的水平、量或比例下降；或者片段化或不需要的同种型的水平、量或比例降低。
18、在一个实施方案中，评估、分类、鉴定、生成或选择用于例如产生产物，例如多肽、重组多肽的细胞或后代细胞或后代细胞群体的方法包括比较蛋白质降解抑制剂(例如蛋白酶体抑制剂)的效果值与参考值。在其中该值与参考值具有预定关系的实施方案中，该方法包括分类或选择细胞或后代细胞或后代细胞群体，例如用于建立培养物，例如细胞合并物。在其中该值满足或超过参考值的一些实施方案中，该方法包括分类或选择后代或后代细胞或后代细胞群体，例如用于建立培养物，例如细胞合并物或用于产生多肽，例如，重组多肽。在其中该值与参考值具有预定关系的实施方案中，该方法包括分类或选择后代或后代细胞或后代细胞群体，例如用于产生多肽，例如重组多肽。在其中该值满足或超过参考值的实施方案中，将细胞或后代细胞或后代细胞群体分类、鉴定或选择为生产细胞或后代细胞或后代细胞群体。在其中所述值与参考值具有预定关系的一些实施方案中，所述方法包括选择细胞(或细胞的后代)，例如用于生成细胞系或细胞群体。
19、在一个实施方案中，与细胞功能相关的参数包括，例如选自：
20、i)细胞存活，
21、ii)培养存活力，
22、iii)产生产物，例如多肽，例如重组多肽的能力，
23、iv)蛋白酶体活性；或
24、v)表达产物，例如多肽，例如重组多肽的质量，例如较同质的产物。
25、在一个实施方案中，该方法包括评估超过一个参数。在一个实施方案中，该方法包括评估超过一个参数，并且将测量的参数与参考值比较。
26、本文还提供了用于从细胞或本文所述细胞的后代细胞建立细胞系的方法。在一个实施方案中，该方法还包括培养细胞以提供培养细胞群体，例如后代细胞群体。在一个实施方案中，该方法还包括从培养细胞群体，例如后代细胞群体中选择细胞。在一个实施方案中，该方法包括对所选择的细胞(或细胞的后代)评估与细胞功能相关的参数，例如，提供参数的值，例如与如本文所述的细胞功能相关的参数。在其中该值与参考值具有预定关系的这些实施方案中，选择细胞(或细胞的后代)，例如，用于产生多肽，例如重组多肽。在其中值满足或超过参考值的实施方案中，选择细胞(或细胞的后代)作为生产细胞。在一个实施方案中，该方法还包括从所述细胞建立细胞系。
27、在一个实施方案中，例如，评估、分类、鉴定、生成或选择用于例如产生产物，例如多肽、重组多肽的细胞或后代细胞或后代细胞群体的方法还包括将外源核酸导入细胞中。在一个实施方案中，外源核酸编码产物，例如重组多肽，或控制例如增加产物(例如内源多肽)表达的外源核酸。在一个实施方案中，在步骤a)、b)、c)和d)中的一个或多个之后导入所述外源核酸。在一个实施方案中，在步骤a)、b)、c)和d)中的一个或多个之前导入所述外源核酸。在一个实施方案中，外源核酸编码多肽，例如重组多肽，例如选自表1或2的治疗性多肽或抗体分子。在一个实施方案中，该方法还包括将一种或多种另外的外源核酸(例如第二外源核酸)导入细胞中。在一个实施方案中，在步骤a)、b)、c)和d)中的一个或多个之后导入第二外源核酸。在一个实施方案中，在步骤a)、b)、c)和d)中的一个或多个之前导入第二外源核酸。在一个实施方案中，在导入第一外源核酸后导入第二外源核酸。在一个实施方案中，在导入第一外源核酸之前导入第二外源核酸。在一个实施方案中，第二外源核酸与第一外源核酸同时导入。在一个实施方案中，第二外源核酸编码选择标志物，例如谷氨酰胺合酶。在一个实施方案中，该方法还包括导入外源核酸，包括转染、电穿孔或转导。
28、在一个实施方案中，例如，评估、分类、鉴定、生成或选择用于例如产生产物，例如多肽、重组多肽的后代细胞或后代细胞群体的方法还包括评估细胞的第二特性，例如，确定细胞是否包含外源组分，例如，一种或多种外源核酸，例如整合到细胞核酸中的一种或多种外源核酸，例如整合到细胞的染色体基因组中的一种或多种外源核酸。在一个实施方案中，该方法包括确定细胞是否包含整合到细胞核酸中的一种或多种外源核酸，例如整合到细胞的染色体基因组中的一种或多种外源核酸，包括msx选择、mtx选择(例如dhfr系统)、抗生素选择、酵母生长选择、基于颜色变化的选择或标志物的表面表达、基于selexis系统的选择、或基于catalant系统的选择。在一个实施方案中，抗生素选择包括选择对选自潮霉素、新霉素(g418)、zeocin、嘌呤霉素或杀稻瘟素的抗生素的抗性。
29、在一个实施方案中，评估、分类、鉴定、生成或选择用于例如产生产物，例如多肽、重组多肽的细胞或后代细胞或后代细胞群体的方法包括评估蛋白质降解抑制剂(例如蛋白酶体抑制剂)对与细胞功能相关的参数(例如，存活、存活力、或增殖能力、或产生产物，例如多肽，例如，由外源核酸表达的多肽)的影响；并且，例如，通过msx选择，确定细胞是否包含整合到细胞的染色体基因组中的外源核酸。在一个实施方案中，其中响应于步骤蛋白质降解抑制剂的影响并步骤确定细胞是否包含整合到细胞的染色体基因组中的外源核酸中的评估，评估、分类、鉴定或选择细胞、后代细胞或后代细胞群体。
30、在一个实施方案中，评估、分类、鉴定、生成或选择用于例如产生产物，例如多肽、重组多肽的细胞或后代细胞或后代细胞群体的方法还包括另外的选择步骤，例如通过facs选择、磁分离，例如磁珠，集落挑选、微流体细胞分选或微流体细胞破坏。在实施方案中，选择步骤包括确定细胞是否包含一种或多种外源核酸。在实施方案中，选择步骤包括确定细胞是否包含整合到细胞核酸中的一种或多种外源核酸，例如整合到细胞的染色体基因组中的一种或多种外源核酸。
31、在一个实施方案中，评估、分类、鉴定、生成或选择用于例如产生产物，例如多肽、重组多肽的细胞或后代细胞或后代细胞群体的方法还包括向细胞中导入辅助蛋白质折叠的试剂，例如伴侣蛋白分子或小化学分子。在一个实施方案中，辅助蛋白质折叠的试剂包含编码伴侣蛋白或蛋白质折叠途径的组分的核酸，例如xbp1、srp14、bip/grp78、pdi、钙联接蛋白或亲环蛋白b。在一个实施方案中，辅助蛋白质折叠的试剂包括选自dmso、甘油或pba的小分子。
32、另一方面，本发明的特征在于生成细胞系或细胞群体的方法，包括通过本文的方法鉴定细胞；并且培养细胞或细胞群体，以提供细胞系或细胞群体。在另一方面，本发明的特征在于生成细胞系或细胞群体的方法，包括通过所述方法鉴定或选择细胞；并培养细胞或细胞群体，以提供细胞系或细胞群体。
33、另一方面，本发明的特征在于生成产物(例如多肽，例如重组多肽)的方法，其包括：提供通过本文所述方法生成的细胞或细胞群体；在培养物中培养细胞或细胞群体；并且任选地，从细胞或培养细胞的培养基中回收产物，例如多肽，例如重组多肽。
34、在另一个方面，本公开内容的特征在于通过本文描述的任何方法评估、分类或选择的细胞、后代细胞或后代细胞群体。
35、另一方面，本发明的特征在于通过本文所述的任何方法生成的细胞、后代细胞或后代细胞群体。
36、在另一个方面，本公开内容的特征在于细胞，后代细胞或后代细胞群体，其可以通过本文描述的任何方法生成。
37、在另一个方面，本公开内容的特征在于产物，例如多肽，例如重组多肽，其由本文所述的任何方法或本文所述的任何细胞产生或可产生。
38、在另一个方面，本公开内容的特征在于包含本文所述产物的制剂，例如，由本文所述的任何方法或本文所述的任何细胞产生或可产生的产物，例如多肽，例如重组多肽。
39、另一方面，本发明的特征在于包含本文所述细胞和本文所述产物，例如多肽，例如重组多肽的混合物。
40、在另一个方面，本公开内容的特征在于通过培养本文所述的细胞、后代细胞或后代细胞群体，例如本文所述的细胞，后代细胞或后代细胞群体条件化的培养基的制剂。
41、另一方面，本发明的特征在于生成产生重组蛋白(例如重组治疗性蛋白质，例如重组治疗性抗体)的细胞或细胞后代的方法，其包括：
42、a)任选地，提供细胞；
43、b)在存在外源蛋白质降解抑制剂，例如蛋白酶体抑制剂、泛素途径抑制剂、或内质网相关降解(erad)抑制剂的情况下培养所述细胞或所述细胞后代(例如，达至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或更多代或达至少12、24、48、72小时或1、2、4、8、16、32或更多周)；
44、c)在缺乏所述外源蛋白质降解抑制剂的情况下培养所述细胞或细胞后代(例如，达至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多代或达至少12、24、48、72小时)；
45、d)任选地，评估所述蛋白质降解抑制剂对由所述细胞或所述细胞后代产生的重组蛋白水平的影响，例如，以获得由所述细胞或所述细胞后代产生的重组蛋白的值；并且
46、e)任选地，将d)中获得的值与参考值比较，其中所述参考值是由在缺乏所述外源蛋白质降解抑制剂的情况下培养的与a)中提供的细胞相同类型的细胞产生的重组蛋白的水平；
47、从而生成所述细胞或细胞后代。
48、本文描述的任何方法或组合物的其他特征或实施方案包括以下一种或多种：
49、蛋白质降解抑制剂
50、在本文所述的任何方法或组合物的实施方案中，蛋白质降解抑制剂是蛋白酶体抑制剂。在一个实施方案中，蛋白酶体抑制剂抑制或降低20s核心亚基、19s调节亚基、11s调节颗粒或辅助蛋白酶体组装的伴侣蛋白，例如hsm3/s5b、nas2/p27、rpn14/paaf1、和nas6/癌性锚蛋白重复序列中的一种或多种的活性。在一个实施方案中，蛋白酶体抑制剂选自mg132(z-lll-al、z-leu-leu-leu-al、z-leu-leu-leu-cho)、环氧霉素(epoxomicin)、硼替佐米(bortezomib)、伊沙佐米(ixazomib)、卡非佐米(carfilzomib)、双硫仑(disulfiram)、cep-18770、onx 0912、盐孢酰胺、llnv、cep1612、乳胞素、ps-341、和eponomicin。
51、在本文所述的任何方法或组合物的实施方案中，蛋白质降解抑制剂是erad抑制剂。在一个实施方案中，erad抑制剂抑制或降低以下一种或多种的活性：钙联接蛋白/钙网织蛋白、udp-葡萄糖-糖蛋白葡萄糖基转移酶、er降解增强性α-甘露糖苷酶样蛋白(edem)、er甘露糖苷酶i、sec61、cdc48p(vcp/p97)、hrd1、doa10、ubc6、ubc1、cue1、或ubc7。在一个实施方案中，蛋白质降解抑制剂是eeyarestatin i。
52、在本文所述的任何方法或组合物的实施方案中，蛋白质降解抑制剂是泛素途径抑制剂。在一个实施方案中，泛素途径抑制剂抑制或降低以下一种或多种的活性：e1泛素激活酶、e2泛素缀合酶或e3泛素连接酶。
53、在本文所述任何方法的实施方案中，该方法还包括使候选细胞与第二蛋白质降解抑制剂，例如蛋白酶体抑制剂、erad抑制剂或泛素途径抑制剂接触。在一个实施方案中，使细胞与第一和第二蛋白质降解抑制剂接触，例如同时或序贯。在一个实施方案中，第一蛋白质降解抑制剂和第二蛋白质降解抑制剂选自mg132、环氧霉素或eeyarestatin 1。在一个实施方案中，使细胞与第一和第二蛋白质降解抑制剂接触，例如，同时或序贯，并且第一抑制剂是蛋白酶体抑制剂，而第二抑制剂是蛋白酶体抑制剂。在一个实施方案中，使细胞与第一和第二蛋白质降解抑制剂接触，例如同时或序贯，并且第一抑制剂是蛋白酶体抑制剂，二第二抑制剂是erad抑制剂或泛素途径抑制剂。在一个实施方案中，使细胞与蛋白质降解的第一和第二抑制剂接触，例如同时或序贯，并且第一抑制剂是erad抑制剂，而第二抑制剂是erad抑制剂。在实施方案中，第一抑制剂不同于第二抑制剂。在一个实施方案中，使细胞与第一和第二蛋白质降解抑制剂接触，例如同时或序贯，并且第一抑制剂是erad抑制剂，而第二抑制剂是泛素途径抑制剂或蛋白酶体抑制剂。在一个实施方案中，使细胞与第一和第二蛋白质降解抑制剂接触，例如同时或序贯，并且第一抑制剂是泛素途径抑制剂，而第二抑制剂是泛素途径抑制剂。在一个实施方案中，使细胞与蛋白质降解的第一和第二抑制剂接触，例如同时或序贯，并且第一抑制剂是泛素途径抑制剂，而第二抑制剂是erad或蛋白酶体抑制剂。
54、在本文所述的任何方法的实施方案中，使细胞与一定浓度的蛋白质降解抑制剂接触，所述浓度足以将培养物存活力降低约10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、或75％、80％、85％、90、95％，例如，与使所述培养物与所述抑制剂接触之前的培养物存活力相比，或与未接触所述抑制剂的培养物相比。在一个实施方案中，蛋白质降解抑制剂的浓度是小于50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、或0.05％总细胞在与蛋白质降解抑制剂接触后在培养物中存活的浓度。在一个实施方案中，蛋白质降解抑制剂的浓度是一种或多种细胞继续增殖的浓度。在一个实施方案中，蛋白质降解抑制剂的浓度小于0.5μm mg-132。在一个实施方案中，蛋白质降解抑制剂的浓度为约0.0625μm mg-132。在一个实施方案中，蛋白质降解抑制剂的浓度为小于0.05μm环氧霉素。在一个实施方案中，蛋白质降解抑制剂的浓度为约0.025μm环氧霉素。在一个实施方案中，蛋白质降解抑制剂的浓度为低浓度的eeyarestatin i，例如0.1μm。在一个实施方案中，蛋白质降解抑制剂的浓度为小于0.5μm的eeyarestatin i，例如约0.1μm的eeyarestatin i。
55、在本文所述的任何方法的实施方案中，使细胞与蛋白质降解抑制剂接触24、48、72、96、或168小时。在本文所述的任何方法的实施方案中，在存在蛋白质降解抑制剂的情况下将细胞(或细胞后代)培养24、48、72、96、小时或更多小时。在本文所述的任何方法的实施方案中，在存在蛋白质降解抑制剂的情况下将细胞(或细胞的后代)培养至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10代或更多代或至少12、24、48、72小时。在本文所述的任何方法的实施方案中，在选择步骤，例如msx选择后使细胞与蛋白质降解抑制剂接触24、48、72、96、或168小时。在本文所述的任何方法的实施方案中，在选择步骤，例如，msx选择之前，使细胞与蛋白质降解抑制剂接触24、48、72、96、或168小时。在本文所述的任何方法的实施方案中，与选择步骤(例如msx选择)同时或并行使细胞与蛋白质降解抑制剂接触。
56、细胞
57、在本文所述的任何方法或组合物的一些实施方案中，该方法包括提供表达多肽，例如重组多肽的细胞，例如包含编码产物，例如多肽，例如重组多肽或控制多肽，例如重组多肽的表达的外源核酸的细胞。
58、在本文所述的任何方法或组合物的实施方案中，细胞包含编码产物，例如多肽，例如重组多肽或控制例如增加多肽，例如重组多肽的表达的外源核酸。在实施方案中，外源核酸包含编码一种或多种(例如两种)重组多肽的核酸序列。在一个实施方案中，细胞是已经在商业上用于产生多肽产物、已经用于产生用于临床前工作的多肽的类型的细胞，或已经用于产生用于临床试验的产物(例如多肽)的细胞。在一个实施方案中，细胞表达多肽，例如重组多肽，选自表1或2。
59、在本文所述的任何方法或组合物的实施方案中，细胞是真核细胞。在一个实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。在一个实施方案中，细胞来自小鼠、大鼠、中国仓鼠、叙利亚仓鼠、猴、猿(例如包括人)、狗、马、骆驼、雪貂或猫。在一个实施方案中，细胞是cho细胞，例如chok1、chok1sv、potelligent chok1sv、cho gs敲除、chok1sv gs-ko、chos、cho dg44、chodxb11、chozn、或cho衍生细胞。在一个实施方案中，细胞选自hela、hek293、h9、hepg2、mcf7、jurkat、nih3t3、pc12、per.c6、bhk、vero、sp2/0、ns0、yb2/0、eb66、c127、l细胞、cos，例如cos1和cos7、qc1-3、chok1、chok1sv、potelligent chok1sv、cho gs敲除、chok1sv gs-ko、chos、cho dg44、cho dxb11、和chozn。
60、在本文所述的任何方法或组合物的实施方案中，细胞是哺乳动物细胞以外的真核细胞。在一个实施方案中，细胞来自昆虫、植物、鸭、鹦鹉、鱼、酵母或真菌。
61、产物
62、如本文所述，由本公开的细胞和方法产生的产物可以是分子、核酸、多肽或其任何融合物或杂合物。在一个实施方案中，产物是非天然存在的物质或分子。在另一个实施方案中，产物是天然存在的物质或分子。工程化改造或修饰产生本文所述产物的细胞以控制例如增加表达，或产生，例如编码本文所述的产物。在一个实施方案中，对细胞进行工程化改造或修饰以包含外源核酸，其控制例如增加内源表达产物的表达。在另一个实施方案中，对细胞进行工程化改造或修饰以包含编码产物的外源核酸，例如内源表达的产物、不由细胞内源产生的产物、或非天然存在的产物。
63、在一个实施方案中，产物，例如多肽，例如重组多肽，是治疗性多肽，例如，用于对患有疾病或病症的受试者施用。在一个实施方案中，产物，例如多肽，例如重组多肽，是诊断性多肽。
64、在本文公开的任何方法或组合物中，产物包含抗体分子、双特异性分子、凝血因子、抗凝血剂、激素、干扰素、白细胞介素或酶中的一种或多种。
65、在一个实施方案中，产物包含抗体分子，例如全长抗体或抗体片段。在一个实施方案中，产物包含与第二试剂(例如多肽，例如毒素)偶联，例如共价或非共价偶联的抗体分子或其片段。在一个实施方案中，抗体分子是单克隆抗体。在一个实施方案中，抗体分子结合肿瘤或癌症相关抗原。在一个实施方案中，抗体分子结合肿瘤相关糖蛋白(tag72)。在一个实施方案中，产物包含双特异性分子，例如，在表2中提供的双特异性分子。
66、在一个实施方案中，产物，例如多肽，例如重组多肽，是人多肽，其氨基酸序列与人多肽的天然存在的同种型没有差异。
67、在另一个实施方案中，产物，例如多肽，例如重组多肽，与人多肽的天然存在的同种型相差不超过1、2、3、4、5、10、15或20个氨基酸残基。
68、在另一个实施方案中，产物，例如多肽，例如重组多肽，与人多肽或蛋白质的天然存在的同种型相差不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或15％的其氨基酸残基。
69、在本文公开的任何方法或组合物中，产物包含选自表1或表2的多肽，例如重组多肽。在一个实施方案中，产物，例如多肽，例如重组多肽，是来自表1或表2的多肽。
70、在另一个实施方案中，产物，例如多肽，例如重组多肽，与表1或表2的多肽相差不超过1、2、3、4、5、10、15或20个氨基酸残基。
71、在另一个实施方案中，产物，例如多肽，例如重组多肽，与来自表1或表2的多肽相差不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或15％的其氨基酸残基。
72、在本文所述的任何方法或组合物中，将包含控制产物表达编码产物(例如重组多肽)的核酸序列的外源核酸导入细胞。在本文所述的任何方法或组合物中，细胞包含外源核酸，其包含编码产物，例如重组多肽的核酸序列。在一个实施方案中，将外源核酸整合到细胞中的核酸中，例如细胞的染色体基因组。在另一个实施方案中，未将外源核酸整合到细胞的染色体基因组中，但是整合在人工染色体或质粒上，例如，使得外源核酸维持在细胞或细胞的后代中。
73、在本文所述的任何方法或组合物中，外源核酸可以进一步包含一个或多个，例如，两个、三个、四个或五个额外的核酸序列，例如，编码产物或其他序列或多肽以控制产物表达。
74、在本文所述的任何方法或组合物中，外源核酸包含质粒或载体，例如表达或病毒载体。在一个实施方案中，外源核酸包含谷氨酰胺合酶(gs)表达载体。在一个实施方案中，外源核酸还包含编码选择标志物的核酸序列。在一个实施方案中，选择标志物包含谷氨酰胺合酶、dhfr或赋予抗生素抗性的基因。在一个实施方案中，编码选择标志物的核酸序列与第一启动子可操作地连接，并且编码产物，例如多肽，例如重组多肽的核酸序列与第二启动子可操作地连接。在一个实施方案中，第一启动子和第二启动子是不同的。在一个实施方案中，与选择标志物可操作连接的启动子是弱启动子，例如sv40e启动子。在一个实施方案中，与编码多肽，例如重组多肽的核酸序列可操作地连接的启动子是强启动子，例如cmv启动子，例如hcmv-mie启动子。
75、在本文所述的任何方法中，该方法包括从细胞或后代细胞中表达产物，例如多肽，例如重组多肽。在一个实施方案中，产物，例如多肽，例如重组多肽从细胞或后代细胞分泌到例如培养基中。
76、在本文所述的任何方法或组合物中，对表达的产物，例如多肽，例如重组多肽评估与物理或功能特性相关的参数，例如，一级序列、糖基化、一级、二级、三级或四级结构、活性、糖基化程度、聚集程度、具有预选性质，例如具有预选的单体、二聚体或三聚体结构的表达产物的比例或水平、或具有预选结构，例如非变性或非聚集结构的表达产物的水平或比例。在实施方案中，该方法包括提供参数的值。在实施方案中，该方法包括将参数的值与参考值比较。
77、在本文所述的任何方法或组合物的实施方案中，蛋白质降解抑制剂(例如蛋白酶体抑制剂)对与细胞功能相关的参数的影响值超过参考值达5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多。在实施方案中，蛋白质降解抑制剂(例如蛋白酶体抑制剂)对与细胞功能相关的参数的影响的值超过参考值达1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍或8倍或更多倍。在实施方案中，参考值是蛋白质降解抑制剂对参考细胞的细胞功能相关的参数的影响值或者对与尚未与蛋白质降解抑制剂接触的细胞的细胞功能相关的参数的影响值。在实施方案中，参数包括产生产物的能力，例如多肽，例如重组多肽，例如从外源核酸表达的重组多肽。在实施方案中，参数包括产生产物(例如多肽，例如重组多肽)的能力，并且其中通过测量或定量细胞中或由细胞分泌的产物(例如，多肽，例如重组多肽)来确定增加。在实施方案中，参数包括细胞存活，并且其中通过测量或定量凋亡细胞的数目来确定增加或减少。在实施方案中，参数包括培养物存活力，并且其中通过测量或定量活细胞的数目来确定增加或减少。
78、在重组多肽从细胞分泌的实施方案中，该方法可以包括从细胞、细胞群体或培养细胞的培养基中回收、收集或分离重组多肽的步骤。
79、在本文所述的任何制剂的某些实施方案中，制剂中按重量或数目计至少70、80、90、95、98或99％的多肽是正确折叠或功能活性的。
80、在本文所述的任何混合物的某些实施方案中，按重量或数目计，所述产物，例如所述多肽，例如所述重组多肽以比尚未与蛋白质降解抑制剂接触的细胞中看到的浓度更高的浓度存在，例如，至少1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更高的浓度；或
81、其中按重量或数目计，所述混合物中的所述产物，例如所述多肽，例如所述重组多肽的至少70、80、90、95、98或99％是正确折叠或功能活性的。
82、在本文所述的任何培养基制剂的某些实施方案中，按重量或数目计，所述产物，例如所述多肽，例如所述重组多肽以比尚未与蛋白质降解抑制剂接触的细胞中看到的浓度更高的浓度存在，例如，高至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、或30％的浓度；或
83、其中按重量或数目计，所述混合物中的所述产物，例如所述多肽，例如所述重组多肽的至少70、80、90、95、98或99％是正确折叠或功能活性的。
84、在实施方案中，本文所述的任何方法还可以包括步骤(f)、(g)或(f)和(g)两者中任一项：
85、f)在缺乏所述外源蛋白质降解抑制剂的情况下培养细胞或细胞后代(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多代或至少12、24、48、72小时)；
86、g)评估由细胞或细胞后代产生的重组蛋白的水平，例如，以获得由细胞或细胞后代产生的重组蛋白的值；和
87、h)任选地，将g)中获得的值与所述参考值比较，其中所述参考值是由在缺乏外源蛋白质降解抑制剂的情况下培养的与a)中提供的细胞相同类型的细胞产生的重组蛋白的水平。
88、在实施方案中，例如，本文的生成方法的实施方案，该方法还包括选择用于制备重组蛋白(例如重组治疗性蛋白)的方法的细胞。在实施方案中，该方法还包括将外源核酸导入细胞中(例如，在步骤c)之后、在步骤d)之后、在步骤e)之后或在步骤f)之后)，任选地，其中导入外源核酸包括转染、电穿孔或转导。
89、除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些方法和材料类似或等同的方法和材料可用于本发明的实践或测试，但下文描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都通过引用整体并入。另外，材料、方法和实例仅是说明性的而不是限制性的。标题、小标题或编号或字母元素，例如(a)、(b)、(i)等，仅为了便于阅读而呈现。在本文件中使用标题或编号或字母元素不要求步骤或元素按字母次序执行，或者步骤或元素必须彼此分离。根据说明书和附图以及权利要求书，本发明的其他特征、目的和优点将显而易见。
1.制备具有改善的生产能力和/或生产改善的质量的重组多肽产品的细胞系的方法，所述方法包括：
2.权利要求1的方法，其中步骤(b)中的所述多肽是由外源核酸编码的重组蛋白质。
3.权利要求1或2的方法，其中与并未接触所述抑制剂的细胞所生产的水平、量或数量相比，在所述抑制剂存在下生产的于步骤(b)中的所述多肽的量是增加的和/或所述改善的所述产品质量包括以下的一种或多种：改善的水平、量，或期望产品的比例，例如与不希望的异构体、片段化的或截断形式相比的比例；改善的水平、量或正确折叠的产品的比例；改善的水平、量，或功能性，例如酶学活性的产品比例；降低的水平、量，或聚集的产品比例；或降低的水平、量，或片段化的或不希望的异构体的比例。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述抑制剂是蛋白酶体抑制剂，任选地其中所述蛋白酶体抑制剂抑制或降低以下一种或多种的活性：20s核心亚基、19s调节亚基、11s调节颗粒、或辅助蛋白酶体组装的伴侣蛋白，例如hsm3/s5b、nas2/p27、rpn14/paaf1和nas6/癌性锚蛋白重复序列(gankyrin)，任选地其中所述蛋白酶体抑制剂选自mg132、环氧霉素(epoxomicin)、硼替佐米(bortezomib)、伊沙佐米(ixazomib)、卡非佐米(carfilzomib)、双硫仑(disulfiram)、cep-18770、onx 0912、盐孢酰胺(salinosporamide)、llnv、cep1612、乳胞素、ps-341、和eponomicin。
5.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述抑制剂是erad抑制剂，任选地，其中所述erad抑制剂抑制或降低以下一种或多种的活性：钙联接蛋白/钙网织蛋白、udp-葡萄糖-糖蛋白葡萄糖基转移酶、er降解增强性α-甘露糖苷酶样蛋白(edem)、er甘露糖苷酶i、sec61、cdc48p(vcp/p97)、hrd1、doa10、ubc6、ubc1、cue1、或ubc7，任选地，其中所述蛋白质降解抑制剂是eeyarestatin i。
6.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述抑制剂是泛素途径抑制剂，任选地，其中所述泛素途径抑制剂抑制或降低以下一种或多种的活性：e1泛素激活酶、e2泛素缀合酶、或e3泛素连接酶。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其还包括：
8.权利要求7的方法，其中：
9.权利要求1-8中任一项的方法，其中使所述细胞与一定浓度的所述蛋白质降解抑制剂接触，所述浓度足以将培养物存活力降低约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％，例如，与使所述培养物与所述抑制剂接触之前的培养物存活力相比，或与未接触所述抑制剂的培养物相比，任选地其中所述蛋白质降解抑制剂的浓度是一种或多种细胞继续增殖的浓度。
10.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述蛋白质降解抑制剂的浓度小于0.5μm mg-132；或小于0.05μm环氧霉素。
11.权利要求1-10中任一项的方法，其中由所述蛋白质降解抑制剂接触所述细胞，例如在所述蛋白质降解抑制剂中培养所述细胞，达24、48、72、96小时或更多小时。
12.权利要求1-11中任一项的方法，其中在选择步骤之前，之后24、48、72、96、或168小时或同时或并行由所述蛋白质降解抑制剂接触所述细胞。
13.权利要求2-12中任一项的方法，其中所述重组多肽选自抗体分子、双特异性分子、凝血因子、抗凝血剂、激素、干扰素、白细胞介素、和选自表1或2的酶。
14.权利要求1-13中任一项的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
15.权利要求1-14中任一项的方法，其中所述细胞来自小鼠、大鼠、中国仓鼠、叙利亚仓鼠、猴、人、狗、骆驼、马、雪貂或猫。
16.权利要求1-15中任一项的方法，其中所述细胞是cho细胞。
17.权利要求1-15中任一项的方法，其中所述细胞选自heia、hek293、h9、hepg2、mcf7、jurkat、nih3t3、pc12、per.c6、bhk、vero、sp2/0、ns0、yb2/0、eb66、c127、l细胞、cos，例如cos1和cos7、qc1-3、chok1、chok1sv、potelligent chok1sv、cho gs敲除、chok1sv gs-ko、chos、cho dg44、cho dxb11、和chozn。
18.权利要求1-17中任一项的方法，其中通过与物理或功能特性相关的参数来评估步骤(b)中的所述多肽，所述参数例如，一级序列、糖基化、一级、二级、三级或四级结构、活性、糖基化程度、聚集程度、具有预选性质，例如具有预选的单体、二聚体或三聚体结构的表达产物的比例或水平、或具有预选结构，例如非变性或非聚集结构的表达产物的水平或比例。
