本发明属于蛋白质互作鉴定，尤其涉及一种基于荧光标记的转录因子互作蛋白分离方法。
背景技术：
1、蛋白质在生物体内发挥着重要的生理功能，可以调控和介导细胞的许多生物学活性。然而蛋白质自身并不具备所有必需的功能，其需要与其他蛋白质互作形成蛋白质复合物来发挥作用。因此，为了更好的理解细胞的生物学活性，必须很好的理解蛋白质单体和蛋白质复合物的功能，这就会涉及到蛋白质相互作用的研究。
2、转录因子是一种蛋白质，可以检测基因组dna中的调节序列，并靶向蛋白质复合物的组装以调节基因表达。除调节功能外，转录因子之间的蛋白质互作在染色质环的调节和蛋白质翻译后修饰中也发挥着重要的作用，深入研究转录因子的蛋白质伴侣以阐明其功能是非常重要的。然而，转录因子的总体丰度较低，与其他蛋白质相比，测定转录因子之间的蛋白质相互作用仍是一个挑战。
3、现有用于蛋白质相互作用研究的技术工具，如酵母双杂交系统、gst pull-down技术、双分子荧光互补技术和免疫共沉淀技术应用于转录因子之间蛋白质互作的研究时，存在着假阴性和假阳性干扰，蛋白背景高的问题，导致后期筛选互作蛋白困难。
4、申请号为cn112858693a的发明专利申请《一种生物分子检测方法》用目的蛋白的抗体直接进行目的蛋白及其复合物的免疫共沉淀，利用生物分子互作分析仪进行蛋白质体外结合试验调取互作结合蛋白。该方法进行抗体制备耗时长且成本高，而且其使用非变性胶page进行蛋白复合物分离的方法在蛋白复合物浓度较低且没有标记指示的情况下，由于背景较高，很难准确分离出目的蛋白复合物。
技术实现思路
1、为解决现有转录因子互作蛋白研究方法存在污染蛋白多、背景高导致互作蛋白筛选困难的问题，本发明提供了一种基于荧光标记的转录因子互作蛋白分离方法。
2、本发明的技术方案：
3、一种基于荧光标记的转录因子互作蛋白分离方法，包括如下步骤：
4、步骤一、构建目的转录因子与标签序列融合的植物表达载体，并转化到根癌农杆菌中；
5、步骤二、将步骤一得到的转化菌通过瞬时转化技术侵染宿主或其他植物，获得含有标签蛋白的转基因植物；
6、步骤三、提取步骤二所得的转基因植物的细胞核，并从所述细胞核中分离核蛋白；
7、步骤四、利用免疫共沉淀或亲和纯化从步骤三所得核蛋白中分离目的蛋白复合物；
8、步骤五、合成包含目标转录因子所结合的dna序列和荧光基团的dna探针；
9、步骤六、将步骤四得到的目的蛋白复合物与步骤五合成的dna探针进行孵育，得到dna-蛋白复合物；
10、步骤七、将步骤六所得dna-蛋白复合物进行非变性胶电泳，对电泳后的非变性胶进行荧光观察，根据荧光指示出蛋白所在的位置，切下发光的复合物进行纯化，质谱测序后获得与目的转录因子互作的蛋白质序列。
11、进一步的，步骤一所述标签序列为strep tag ii标签、flag-tag标签、twin-strep-tag标签或poly-his tag标签的序列。
12、进一步的，步骤一所述植物表达载体为prokii载体、pcambia1301载体、pcambia3300载体、pbin系列载体或pgex系列载体。
13、进一步的，步骤四进行免疫共沉淀或亲和纯化时使用与目的转录因子所带标签亲和的磁珠或抗体。
14、进一步的，步骤四对免疫共沉淀或亲和纯化后的磁珠或抗体进行洗脱以分离目的蛋白复合物。
15、进一步的，步骤五先合成包含目的转录因子所结合的dna元件和荧光基团的互补单链dna序列，然后将合成的互补单链dna序列退火成双链，得到长度为20～50bp的dna探针。
16、进一步的，步骤五所述dna探针中，荧光基团在序列末端。
17、进一步的，步骤五所述荧光基团为cy3、cy5、cy7、fitc、fam、hex、tet或rox。
18、进一步的，步骤六孵育时加入protein/dnabindingbuffer，混匀后室温放置，使得dna和目的蛋白复合物结合。
19、进一步的，步骤七所述非变性胶电泳为非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳或琼脂糖凝胶电泳进行交联产物的emsa电泳。
20、本发明的有益效果：
21、本发明提供了一种基于荧光标记的转录因子互作蛋白分离方法，先利用标签抗体或亲和磁珠进行免疫共沉淀或亲和纯化，再利用非变性胶电泳在荧光标记的指示下进行切胶纯化蛋白，通过两轮纯化减少蛋白的非特异性结合，高效去除背景蛋白，有效解决了现有方法污染蛋白多、背景高导致互作蛋白筛选困难的问题，进一步完善了研究蛋白质互作的互作蛋白分离方法，使得蛋白质互作的鉴定能够更为准确、高效。
22、本发明将目的蛋白与标签蛋白进行融合，结合瞬时转化技术，可以方便地用标签蛋白来调取目的蛋白复合物。同时，通过蛋白与荧光dna探针进行结合，根据荧光标记位置，可以准确地回收目的蛋白复合物。
23、本发明使用的标签具有可替代性，所进行的免疫共沉淀和亲和纯化不受标签种类限制；使用荧光emsa进行切胶纯化蛋白，不需要转膜、洗膜及化学发光检测，操作简单快速，使得本发明具有广泛应用。本发明基于荧光标记的转录因子互作蛋白分离方法，只需要获得含有目的转录因子的农杆菌工程菌，并利用高效的瞬时转化技术即可对待试植物材料进行操作，不依赖可用或不可用的遗传转化系统，因此适用于所有能被根癌农杆菌侵染的植物物种的转录因子互作蛋白的分离，为植物获得高质量互作蛋白提供了重要方法。
1.一种基于荧光标记的转录因子互作蛋白分离方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述一种基于荧光标记的转录因子互作蛋白分离方法，其特征在于，步骤一所述标签序列为strep tag ii标签、flag-tag标签、twin-strep-tag标签或poly-his tag标签的序列。
3.根据权利要求1或2所述一种基于荧光标记的转录因子互作蛋白分离方法，其特征在于，步骤一所述植物表达载体为prokii载体、pcambia1301载体、pcambia3300载体、pbin系列载体或pgex系列载体。
4.根据权利要求3所述一种基于荧光标记的转录因子互作蛋白分离方法，其特征在于，步骤四进行免疫共沉淀或亲和纯化时使用与目的转录因子所带标签亲和的磁珠或抗体。
5.根据权利要求4所述一种基于荧光标记的转录因子互作蛋白分离方法，其特征在于，步骤四对免疫共沉淀或亲和纯化后的磁珠或抗体进行洗脱以分离目的蛋白复合物。
6.根据权利要求5所述一种基于荧光标记的转录因子互作蛋白分离方法，其特征在于，步骤五先合成包含目的转录因子所结合的dna元件和荧光基团的互补单链dna序列，然后将合成的互补单链dna序列退火成双链，得到dna探针。
7.根据权利要求6所述一种基于荧光标记的转录因子互作蛋白分离方法，其特征在于，步骤五所述dna探针中，荧光基团在序列末端。
8.根据权利要求7所述一种基于荧光标记的转录因子互作蛋白分离方法，其特征在于，步骤五所述荧光基团为cy3、cy5、cy7、fitc、fam、hex、tet或rox。
9.根据权利要求8所述一种基于荧光标记的转录因子互作蛋白分离方法，其特征在于，步骤六孵育时加入protein/dnabinding buffer，混匀后室温放置，使得dna和目的蛋白复合物结合。
10.根据权利要求9所述一种基于荧光标记的转录因子互作蛋白分离方法，其特征在于，步骤七所述非变性胶电泳为非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳或琼脂糖凝胶电泳进行交联产物的emsa电泳。
