本发明属于微生物，涉及一株生产葡半乳聚糖的中华根瘤菌及其应用。
背景技术：
1、葡半乳聚糖(glucogalactan)也被称为半乳葡聚糖(galactoglucan)，是一类由葡萄糖、半乳糖聚合而成的大分子线性或支链多糖，部分还含有甘露糖、阿拉伯糖、木糖、果糖、葡萄糖醛酸等单糖，另外，部分葡半乳聚糖含有丙酮酰、乙酰及丁二酰(琥珀酰)等修饰基团。目前已经从植物(如南瓜、金桔)、大型真菌(如灵芝、茯苓)、真菌(如链格孢、镰刀菌)和细菌(如戊糖乳杆菌、根瘤菌)中分离鉴定出数十种葡半乳聚糖，其葡萄糖和半乳糖的摩尔比不同，所含有的其它单糖组分和修饰基团各异。研究发现，葡半乳聚糖具有吸湿保湿、抗氧化、维持肠道微生物菌群稳态、降低血糖、调节免疫力、抗肿瘤等多种重要的活性，在食品、保健品、化妆品、药物等领域极具应用潜力。但是，目前葡半乳聚糖存在分离和纯化工艺复杂，回收率和产量低，难以规模化应用的问题。因此，寻找具有高产葡半乳聚糖潜力的微生物，提高多糖产量，对葡半乳聚糖的生产和应用均具有重要意义。
2、根瘤菌在豆科植物共生固氮中发挥着核心作用。研究发现，根瘤菌科细菌分泌的胞外多糖大多是葡半乳聚糖(janczarek m.international journal of molecularsciences,2011,12,7898-7933；acosta-jurado s,et al.international journal ofmolecular sciences,2021,22,6233.)。因此，根瘤菌成为生产葡半乳聚糖的潜在微生物工厂。例如，草木樨中华根瘤菌(sinorhizobium meliloti)能够合成由葡萄糖和半乳糖二糖重复单元组成的葡半乳聚糖(epsii)(mendrygal k e,et al.journal of bacteriology,2008,190(10):3456-3466)。但是通常情况下，草木樨中华根瘤菌主要合成琥珀酰聚糖(epsi)，其由八糖重复单元组成，葡萄糖和半乳糖摩尔比为7:1。在epsi合成过程中，半乳糖基转移酶exoy(编码基因exoy)将半乳糖苷连接至脂载体，是epsi合成的第一步，而全局调控蛋白mucr(编码基因mucr)促进epsi的合成，同时抑制epsii的合成(rinaudi et al.femsmicrobiology letters,2010,302:15-21)。因此，一般情况下很难获得较高产量的由葡萄糖和半乳糖二糖单元组成的葡半乳聚糖。尽管早有文献报道敲除exoy能够实现草木樨中华根瘤菌胞外分泌epsii(mendrygal k e,et al.journal of bacteriology,2000,182:599-606)，但仍无法实现胞外epsii的大量合成。
3、通过筛选特定菌种，有助于获得较高产量的葡半乳聚糖。如moretto等筛选到一株根瘤菌rhizobium sp.lbmp-c04，其胞外多糖产量最高达到6.63g/l，为公开报道的较高水平，然而其单糖组成为葡萄糖：半乳糖：甘露糖：葡萄糖醛酸：鼠李糖＝54.17：38.99：2.68：3.57：0.60(international journal of biological macromolecules,2015,81:291-298)，这与葡萄糖和半乳糖单元等摩尔比的葡半乳聚糖尚有差异。综上，通过菌种筛选获得高产葡半乳聚糖的特定根瘤菌，对葡半乳聚糖的规模化生产及应用具有重要意义。
技术实现思路
1、本发明的目的之一在于提供一株中华根瘤菌(sinorhizobium sp.)act002。该菌株经分子生物学鉴定为中华根瘤菌属，已于2024年1月9日在中国典型培养物保藏中心(cctcc)进行保藏，保藏编号为cctcc no:m 2024038，保藏地址为中国武汉市武汉大学。
2、本发明的目的之二在于提供上述中华根瘤菌act002的培养方法，具体步骤如下：
3、将中华根瘤菌act002种子液接种至发酵培养基中，在28～35℃下振荡培养，所述的发酵培养基的组成为：蔗糖15～60g/l，酵母提取物0.5～2.5g/l，nano3 1～3g/l，kcl0.5～1g/l，mgso4 0.5～1g/l，feso4 0.01～0.05g/l，碱性盐1～5g/l，ph＝6.5～7.5。
4、优选地，中华根瘤菌act002种子液的接种量为0.5％～5％，碱性盐为na2co3、nahco3或tris。
5、本发明的目的之三在于提供一种葡半乳聚糖，为由β-d-葡萄糖(β-d-glc)和α-d-半乳糖(α-d-gal)通过1→3糖苷键交替连接而成的直链多糖，葡萄糖和半乳糖的摩尔比为1:1，并且含有乙酰基和丙酮酰基修饰，摩尔比为1:10，重均分子量为1.0×106～3.8×107da，结构式为：
6、
7、，其中n＝2500～95000，β-1,3-葡萄糖c6位被乙酰基修饰，取代度10％，α-1,3-半乳糖c4和c6位被丙酮酸基团修饰形成丙酮酰缩酮基，取代度100％。
8、本发明的目的之四在于提供上述葡半乳聚糖的生产方法，包括以下步骤：
9、(1)中华根瘤菌act002的发酵：
10、将中华根瘤菌act002种子液接种至发酵培养基中，在28～35℃下振荡培养，所述的发酵培养基的组成为：蔗糖15～60g/l，酵母提取物0.5～2.5g/l，nano3 1～3g/l，kcl0.5～1g/l，mgso4 0.5～1g/l，feso4 0.01～0.05g/l，碱性盐1～5g/l，ph＝6.5～7.5；
11、(2)葡半乳聚糖粗品的分离：
12、将步骤(1)获得的发酵液离心，弃沉淀收集上清液，在上清液中加入无水乙醇，震荡使多糖析出，过滤回收沉淀，干燥，得到葡半乳聚糖粗品。
13、优选地，步骤(1)中，振荡培养的时间为36～72h。
14、优选地，步骤(2)中，离心转速为5000g，离心时间为30min；无水乙醇的加入量为上清液体积的2～3倍，干燥温度为50～75℃。
15、本发明的目的之五在于提供上述葡半乳聚糖的纯化方法，包括以下步骤：
16、(1)将葡半乳聚糖粗品溶解于水中，离心，弃沉淀收集上清液；
17、(2)在步骤(1)获得的上清液中加入等体积的氯仿/正丁醇溶剂，其中氯仿与正丁醇的体积比为4:1，震荡，离心，回收水相；
18、(3)重复步骤(2)，直至水相与有机相界面蛋白层消失，在回收的水相中加入无水乙醇，震荡使多糖析出，过滤回收沉淀，干燥，得到葡半乳聚糖纯品。
19、优选地，步骤(1)或(2)中，离心转速为5000g，离心时间为30min.
20、优选地，步骤(3)中，无水乙醇的加入量为水相体积的2～3倍，干燥温度为50～75℃。
21、本发明的目的之六在于提供上述葡半乳聚糖在制备促进皮肤伤口愈合药物中的应用。
22、与现有技术相比，本发明具有以下优点：
23、(1)本发明筛选获得的中华根瘤菌act002能够单一合成由葡萄糖和半乳糖二糖单元组成的葡半乳聚糖，克服了传统草木樨中华根瘤菌产糖种类不单一，葡半乳聚糖(epsii)产量低的缺点，并且具有优异的产胞外多糖能力，生产葡半乳聚糖粗糖的产量可达16.5g/l，明显高于已报道的根瘤菌产胞外多糖的水平。
24、(2)本发明的葡半乳聚糖能够有效促进皮肤伤口愈合，在医药领域具有广阔的应用前景。
1. 中华根瘤菌（sinorhizobium sp.）act002，保藏编号为cctcc no: m 2024038。
2.根据权利要求1所述的中华根瘤菌act002的培养方法，其特征在于，具体步骤如下：
3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，中华根瘤菌act002种子液的接种量为0.5%~5%，碱性盐为na2co3、nahco3或tris。
4. 一种葡半乳聚糖，其特征在于，为由β-d-葡萄糖和α-d-半乳糖通过1→3糖苷键交替连接而成的直链多糖，葡萄糖和半乳糖的摩尔比为1:1，并且含有乙酰基和丙酮酰缩酮基修饰，摩尔比为1:10，重均分子量为1.0×106 ~ 3.8×107 da，结构式为：
5.如权利要求4所述的葡半乳聚糖的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：
6. 根据权利要求5所述的生产方法，其特征在于，步骤（1）中，振荡培养的时间为36~72h；步骤（2）中，离心转速为5000 g，离心时间为30 min；无水乙醇的加入量为上清液体积的2~3倍，干燥温度为50~75℃。
7.如权利要求4所述的葡半乳聚糖的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
8. 根据权利要求7所述的纯化方法，其特征在于，步骤（1）或（2）中，离心转速为5000g，离心时间为30 min。
9.根据权利要求7所述的纯化方法，其特征在于，步骤（3）中，无水乙醇的加入量为水相体积的2~3倍，干燥温度为50~75℃。
10.如权利要求4所述的葡半乳聚糖在制备促进皮肤伤口愈合药物中的应用。
