本发明涉及生物医学，尤其涉及检测tcf1+bcl11b+cd8+t细胞亚群的辅助预测cd3cd19双特异性抗体治疗疗效的试剂盒及其应用。
背景技术：
1、急性淋巴细胞白血病(all)是一种早期分化受阻的淋巴细胞恶性增殖性疾病，以b细胞急性淋巴细胞白血病(b-all)为主，成人5年os率仅30～40％，复发后5年生存率仅为10％。一旦复发或难治，多药联合化疗方案的缓解率低，疗效持续短，易复发，预后差。
2、近年来，随着cd3cd19双特异性单抗等细胞免疫治疗方式的兴起与发展，进一步优化成人all的治疗，不仅获得明显优于常规化疗的更早更深的缓解，还创造更多异基因造血干细胞移植的机会，延长患者生存时间。然而，仍有30-40％的患者疗效欠佳，达不到深度缓解或者疗效持续时间短，并且这些新型免疫治疗药物价格昂贵。因此，临床亟需探索预测细胞免疫治疗疗效的免疫指标，从而筛选更合适的患者及开展更精准的治疗。
3、机制研究表明cd3cd19双特异性单抗等细胞免疫治疗高度依赖患者t细胞的功能状态，目前根据cd4+/cd8+t细胞亚群分布、计数和比例变化等，并不能精准判断t细胞的功能，目前临床上尚没有用来评估和预测cd3cd19双特异性抗体疗效的t细胞免疫功能指标。
4、转录因子t细胞因子1(tcf1)是细胞毒t淋巴细胞(cytotoxic t lymphocytes,ctl)响应病毒或肿瘤抗原而产生cd8+t细胞的干细胞样自我更新以及保持t细胞长期有效杀伤活性所必需的。tcf1是调控t细胞功能状态的重要靶点，可调控记忆t细胞分化，在二次应答中发挥重要作用。bcl11b，也是参与t细胞分化的关键转录因子，可促进胸腺内t细胞发育分化，维持外周t细胞的活化增殖和效应功能活性。研究发现敲除bcl11b能明显降低幼稚cd8+t细胞的数量，抑制细胞毒t淋巴细胞的活性，导致耗竭相关分子表达增加、记忆细胞生成减少，促进效应t细胞终末分化。因此，基于tcf1有助于记忆细胞分化和bcl11b有助于维持t细胞的效应功能的特性，tcf1+bcl11b+cd8+t细胞是一种新发现的可用于判断t细胞长期杀伤活性的、特殊类型的cd8+t细胞亚群。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供检测tcf1+bcl11b+cd8+t细胞亚群的辅助预测cd3cd19双特异性抗体治疗疗效的试剂盒及其检测方法，利用所述技术方案可将上述t细胞亚群进行量化，通过外周血中cd3+cd8+t细胞中tcf1+bcl11b+双阳性细胞比例变化趋势来表明治疗的疗效，这在辅助预判cd3cd19双特异性抗体治疗的疗效以及精准选择治疗方案方面具有非常广阔的应用前景。
2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
3、本发明提供了一种辅助预测cd3cd19双特异性抗体疗效的试剂盒，该试剂盒能够用于检测tcf1+bcl11b+cd8+t细胞亚群，所述的试剂盒包括单克隆抗体、荧光标记指示剂、人外周血淋巴细胞分离液、转录因子缓冲液以及磷酸盐缓冲溶液。
4、作为优选，所述单克隆抗体包括抗cd3抗体、抗cd8抗体、抗tcf1抗体以及抗bcl11b抗体。
5、作为优选，所述荧光标记指示剂包括apc-cy7、a700、pe以及fitc。
6、本发明还提供了一种非疾病诊断或治疗目的的辅助预测cd3cd19双特异性抗体疗效的检测方法，利用上述试剂盒进行检测，包括如下步骤：
7、处理待测样本b-all患者外周血，获得淋巴细胞悬液后，加入膜表面标记不同荧光的单克隆抗体，避光孵育，然后加入转录因子缓冲液进行重悬破核膜，洗涤后加入细胞核内标记不同荧光的转录因子单克隆抗体，再次避光孵育。
8、作为优选，外周血中cd3+cd8+t细胞中tcf1+bcl11b+双阳性细胞比例高于34.765％，且呈增高趋势时，则预示治疗有效；外周血中cd3+cd8+t细胞中tcf1+bcl11b+双阳性细胞比例低于34.765％，且呈降低趋势时，则预示治疗效果差或无效。
9、作为优选，所述膜表面标记不同荧光的单克隆抗体为抗cd3抗体和抗cd8抗体，所述细胞核内标记不同荧光的单克隆抗体为抗tcf1抗体和抗bcl11b抗体。
10、作为优选，所述淋巴细胞悬液、抗cd3抗体和抗cd8抗体的体积比为(8-15)：1：1。
11、作为优选，所述淋巴细胞悬液、抗tcf1抗体和抗bcl11b抗体的体积比为100：(0.5-3)：(0.5-2)。
12、作为优选，所述淋巴细胞悬液的细胞浓度为(3-8)×105个/100μl。
13、通过采用上述技术方案，本发明具有如下有益效果：
14、1.本发明利用所述技术方案可将tcf1+bcl11b+cd8+t细胞亚群进行量化，并首次发现外周血中cd3+cd8+t细胞中tcf1+bcl11b+双阳性细胞比例与cd3cd19双特异性抗体治疗的疗效存在密切的关系，也为进一步临床上应用上述指标辅助评判cd3cd19双特异性抗体治疗疗效提供了理论支撑。
15、2.本发明实施例表明对b-all患者外周血中tcf1+bcl11b+cd8+t细胞亚群比例进行检测，利用检测数值进行roc曲线分析获得截断值为34.765％，所述tcf1+bcl11b+t细胞亚群在cd3+cd8+t细胞中所占比例大于34.765％，治疗有效的可能性较大。当外周血中cd3+cd8+t细胞中tcf1+bcl11b+双阳性细胞的比例高于34.765％，且呈增高趋势，尤其在治疗后第14天时的水平明显增高，预示b-all患者对cd3cd19双特异性抗体治疗的疗效佳。
1.一种辅助预测cd3cd19双特异性抗体疗效的试剂盒，其特征在于，该试剂盒能够用于检测tcf1+bcl11b+cd8+t细胞亚群，所述的试剂盒包括单克隆抗体、荧光标记指示剂、人外周血淋巴细胞分离液、转录因子缓冲液以及磷酸盐缓冲溶液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述单克隆抗体包括抗cd3抗体、抗cd8抗体、抗tcf1抗体以及抗bcl11b抗体。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光标记指示剂包括apc-cy7、a700、pe以及fitc。
4.一种非疾病诊断或治疗目的的辅助预测cd3cd19双特异性抗体疗效的检测方法，其特征在于，利用权利要求1-3任一项所述试剂盒进行检测，包括如下步骤：
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述膜表面标记不同荧光的单克隆抗体为抗cd3抗体和抗cd8抗体，所述细胞核内标记不同荧光的单克隆抗体为抗tcf1抗体和抗bcl11b抗体。
6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述淋巴细胞悬液、抗cd3抗体和抗cd8抗体的体积比为(8-15)：1：1；
7.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述淋巴细胞悬液的细胞浓度为(3-8)×105个/100μl。
