本公开内容一般涉及分子生物学领域，特别涉及使用分子条形码化的多组学分析。
背景技术：
1、诸如分子条形码化的方法和技术对于单细胞转录组学分析是有用的，特别是使用例如逆转录、聚合酶链式反应(pcr)扩增、和下一代测序(ngs)来解密基因表达谱以确定细胞的状态。分子条形码化还可用于单细胞蛋白质组学分析。
技术实现思路
1、本文公开了用于将寡核苷酸条形码附接至样品中的靶的方法。举例来说，靶可以包含核酸靶，基本上由核酸靶组成或由核酸靶组成。在一些实施例中，所述方法包括：使用多个寡核苷酸条形码对样品中的核酸靶的拷贝进行条形码化，以产生多个经条形码化的核酸分子，每个经条形码化的核酸分子包含所述核酸靶的序列、分子标记和靶结合区，并且其中所述多个寡核苷酸条形码中的至少10个包含不同的分子标记序列；将包含所述靶结合区的互补体的寡核苷酸附接至所述多个经条形码化的核酸分子，以产生多个经条形码化的核酸分子，每个经条形码化的核酸分子包含所述靶结合区和所述靶结合区的互补体；使所述多个经条形码化的核酸分子中的每一个内的所述靶结合区和所述靶结合区的互补体杂交以形成茎环；并且延伸所述多个经条形码化的核酸分子的3’末端以延伸所述茎环，以产生多个经延伸的经条形码化的核酸分子，每个经延伸的经条形码化的核酸分子包含所述分子标记和所述分子标记的互补体。任选地，所述方法进一步包括扩增所述多个经条形码化的核酸分子以产生多个经扩增的经条形码化的核酸分子。附接包含靶结合区的互补体的寡核苷酸可以包括将寡核苷酸附接到多个经扩增的经条形码化的核酸分子，以产生多个经条形码化的核酸分子，每个经条形码化的核酸分子包含靶结合区和靶结合区的互补体。任选地，所述方法进一步包括扩增多个经延伸的经条形码化的核酸分子。样品中的核酸靶的数量可以在扩增多个经延伸的经条形码化的核酸分子之后确定。在一些实施例中，所述方法包括：基于与多个经延伸的经条形码化的核酸分子相关联的具有不同序列的分子标记、其互补序列或其组合的数量，确定样品中的核酸靶的数量。在一些实施例中，所述方法包括：基于与多个经延伸的经条形码化的核酸分子相关联的具有不同序列的分子标记的数量，确定样品中的核酸靶的数量。
2、本文公开了用于确定样品中的靶数量的方法。举例来说，靶可以包含核酸，基本上由核酸组成或由核酸组成。在一些实施例中，所述方法包括：使用多个寡核苷酸条形码对样品中的核酸靶的拷贝进行条形码化，以产生多个经条形码化的核酸分子，每个经条形码化的核酸分子包含所述核酸靶的序列、分子标记和靶结合区，并且其中所述多个寡核苷酸条形码中的至少10个包含不同的分子标记序列；将包含所述靶结合区的互补体的寡核苷酸附接至所述多个经条形码化的核酸分子，以产生多个经条形码化的核酸分子，每个经条形码化的核酸分子包含所述靶结合区和所述靶结合区的互补体；使所述多个经条形码化的核酸分子中的每一个内的所述靶结合区和所述靶结合区的互补体杂交以形成茎环；延伸所述多个经条形码化的核酸分子的3’末端以延伸所述茎环，以产生多个经延伸的经条形码化的核酸分子，每个经延伸的经条形码化的核酸分子包含所述分子标记和所述分子标记的互补体；并且基于与多个经延伸的经条形码化的核酸分子相关联的具有不同序列的分子标记的互补序列的数量，确定样品中的核酸靶的数量。任选地，所述方法进一步包括扩增所述多个经条形码化的核酸分子以产生多个经扩增的经条形码化的核酸分子。附接包含靶结合区的互补体的寡核苷酸可以包括将寡核苷酸附接到多个经扩增的经条形码化的核酸分子，以产生多个经条形码化的核酸分子，每个经条形码化的核酸分子包含靶结合区和靶结合区的互补体。任选地，所述方法进一步包括扩增多个经延伸的经条形码化的核酸分子。样品中的核酸靶的数量可以在扩增多个经延伸的经条形码化的核酸分子之后确定。在一些实施例中，所述方法包括基于与多个经延伸的经条形码化的核酸分子相关联的具有不同序列的分子标记、其互补序列或其组合的数量，确定样品中的核酸靶的数量。
3、在一些实施例中，本文描述的方法中的任一个包括对多个靶的拷贝进行条形码化，包括：使所述核酸靶的拷贝与所述多个寡核苷酸条形码接触，其中所述多个寡核苷酸条形码中的每一个包含能够与所述核酸靶杂交的靶结合区；并且延伸与寡核苷酸条形码杂交的核酸靶的拷贝，以产生多个经条形码化的核酸分子。在一些实施例中，本文描述的方法中的任一个包括：对所述多个靶的拷贝进行条形码化包括：使核酸靶的拷贝与多个寡核苷酸条形码接触，其中多个寡核苷酸条形码中的每一个包含靶结合区。靶结合区可以与核酸靶杂交。所述方法可以进一步包括延伸与寡核苷酸条形码杂交的核酸靶的拷贝，以产生多个经条形码化的核酸分子。
4、在一些实施例中，本文描述的方法中的任一个包括：扩增多个经条形码化的核酸分子以产生多个经扩增的经条形码化的核酸分子，其中将包含靶结合区的互补体的寡核苷酸附接包括：将包含靶结合区的互补体的寡核苷酸附接至所述多个经扩增的经条形码化的核酸分子，以产生多个经条形码化的核酸分子，每个经条形码化的核酸分子包含靶结合区和靶结合区的互补体。
5、在一些实施例中，本文描述的方法中的任一个包括：扩增多个经延伸的经条形码化的核酸分子，以产生多个经单标记的核酸分子，每个经单标记的核酸分子包含分子标记的互补体，其中确定样品中的核酸靶的数量包括：基于与所述多个经单标记的核酸分子相关联的具有不同序列的分子标记的互补序列的数量，确定所述样品中的所述核酸靶的数量。
6、在一些实施例中，所述方法包括：扩增多个经延伸的经条形码化的核酸分子，以产生多个经延伸的经条形码化的核酸分子的拷贝，其中确定样品中的核酸靶的数量包括：基于与所述多个经延伸的经条形码化的核酸分子的拷贝相关联的具有不同序列的分子标记的互补序列的数量，确定所述样品中的所述核酸靶的数量。
7、本文公开了用于确定样品中的核酸靶数量的方法。在一些实施例中，所述方法包括：使样品中的核酸靶的拷贝与多个寡核苷酸条形码接触，其中所述多个寡核苷酸条形码中的每个包含分子标记和能够与所述核酸靶杂交的靶结合区，并且其中所述多个寡核苷酸条形码中的至少10个包含不同的分子标记序列；延伸与所述寡核苷酸条形码杂交的核酸靶的拷贝以产生多个核酸分子，每个核酸分子包含与所述核酸靶的至少一部分互补的序列；扩增多个经条形码化的核酸分子以产生多个经扩增的经条形码化的核酸分子；将包含所述靶结合区的互补体的寡核苷酸附接至所述多个经扩增的经条形码化的核酸分子，以产生多个经条形码化的核酸分子，每个经条形码化的核酸分子包含所述靶结合区和所述靶结合区的互补体；使所述多个经条形码化的核酸分子中的每一个内的所述靶结合区和所述靶结合区的互补体杂交以形成茎环；延伸所述多个经条形码化的核酸分子的3’末端以延伸所述茎环，以产生多个经延伸的经条形码化的核酸分子，每个经延伸的经条形码化的核酸分子包含所述分子标记和所述分子标记的互补体；扩增所述多个经延伸的经条形码化的核酸分子，以产生多个经单标记的核酸分子，每个经单标记的核酸分子包含所述分子标记的所述互补体；并且基于与多个经单标记的核酸分子相关联的具有不同序列的分子标记的互补序列的数量，确定样品中的核酸靶的数量。
8、在一些实施例中，对于本文所述的方法中的任一个，在延伸多个经条形码化的核酸分子的3’末端之后，将分子标记与分子标记的互补体杂交，所述方法包括使多个经延伸的经条形码化的核酸分子变性，之后扩增多个经延伸的经条形码化的核酸分子以产生多个经单标记的核酸分子。使样品中的核酸靶的拷贝接触可以包括使多个核酸靶的拷贝接触多个寡核苷酸条形码。延伸核酸靶的拷贝可包括延伸与寡核苷酸条形码杂交的多个核酸靶的拷贝，以产生多个经条形码化的核酸分子，每个经条形码化的核酸分子包含与多个核酸靶中之一的至少一部分互补的序列。确定核酸靶的数量可包括基于与包含多个核酸靶中的每一个的序列的多个经单标记的核酸分子的经单标记的核酸分子相关联的具有不同序列的分子标记的互补序列的数量，确定样品中的多个核酸靶中各自的数量。多个核酸靶中的每个的序列可以包含多个核酸靶中的每个的子序列。
9、在一些实施例中，对于本文所述的方法中的任一个，多个经条形码化的核酸分子中的核酸靶的序列包含核酸靶的子序列。靶结合区可包含基因特异性序列。附接包含靶结合区的互补体的寡核苷酸可以包括将包含靶结合区的互补体的寡核苷酸与多个经条形码化的核酸分子连接。
10、在一些实施例中，对于本文所述的方法中的任一个，靶结合区可包含聚(dt)序列，其中附接包含靶结合区的互补体的寡核苷酸包括：使用末端脱氧核苷酸转移酶将多个腺苷一磷酸添加至所述多个经条形码化的核酸分子。
11、在一些实施例中，对于本文所述的方法中的任一个，延伸与寡核苷酸条形码杂交的核酸靶的拷贝可包括逆转录与寡核苷酸条形码杂交的核酸靶的拷贝以产生多个经条形码化的互补脱氧核糖核酸(cdna)分子。延伸与寡核苷酸条形码杂交的核酸靶的拷贝可包括使用缺乏5’至3’核酸外切酶活性和3’至5’核酸外切酶活性中至少一种的dna聚合酶延伸与寡核苷酸条形码杂交的核酸靶的拷贝。dna聚合酶可以包含克列诺(klenow)片段。
12、在一些实施例中，本文描述的方法中的任一个包括：获得所述多个经延伸的经条形码化的核酸分子的序列信息。获得序列信息可以包括将测序衔接子附接到多个经延伸的经条形码化的核酸分子。
13、在一些实施例中，对于本文所述的方法中的任一个，靶结合区的互补体可包含靶结合区的反向互补序列。靶结合区的互补体可以包含靶结合区的互补序列。分子标记的互补体可以包含分子标记的反向互补序列。分子标记的互补体可以包含分子标记的互补序列。
14、在一些实施例中，对于本文所述的方法中的任一个，多个经条形码化的核酸分子可包含经条形码化的脱氧核糖核酸(dna)分子。经条形码化的核酸分子可以包含经条形码化的核糖核酸(rna)分子。核酸靶可以包含核酸分子。核酸分子可包含核糖核酸(rna)、信使rna(mrna)、微小rna、小干扰rna(sirna)、rna降解产物、包含聚(a)尾的rna、或其任意组合。
15、在一些实施例中，对于本文所述的方法中的任一个，核酸靶可包含细胞组分结合试剂。核酸分子可以与细胞组分结合试剂相关联。所述方法可以包括：使所述核酸分子和所述细胞组分结合试剂解离。
16、在一些实施例中，对于本文所述的方法中的任一个，多个寡核苷酸条形码的每个分子标记包含至少6个核苷酸。寡核苷酸条形码可以包含相同的样品标记。多个寡核苷酸条形码的每个样品标记可包含至少6个核苷酸。寡核苷酸条形码可以包含相同的细胞标记。多个寡核苷酸条形码的每个细胞标记可包含至少6个核苷酸。
17、在一些实施例中，对于本文所述的方法中的任一个，当使多个经条形码化的核酸分子中的每个之内的靶结合区和靶结合区的互补体杂交形成茎环时，多个经条形码化的核酸分子中的至少一个与固体支持物相关联。当使多个经条形码化的核酸分子中的每个之内的靶结合区和靶结合区的互补体杂交形成茎环时，多个经条形码化的核酸分子中的至少一个可以与固体支持物解离。当使多个经条形码化的核酸分子中的每个之内的靶结合区和靶结合区的互补体杂交形成茎环时，多个经条形码化的核酸分子中的至少一个可以与固体支持物相关联。
18、在一些实施例中，对于本文所述的方法中的任一个，当延伸多个经条形码化的核酸分子的3’末端以延伸茎环从而产生多个经延伸的经条形码化的核酸分子(每个经延伸的经条形码化的核酸分子包含分子标记和分子标记的互补体)时，多个经条形码化的核酸分子中至少一个与固体支持物相关联。当延伸多个经条形码化的核酸分子的3’末端以延伸茎环从而产生多个经延伸的经条形码化的核酸分子(每个经延伸的经条形码化的核酸分子包含分子标记和分子标记的互补体)时，多个经条形码化的核酸分子中至少一个可以与固体支持物解离。当延伸多个经条形码化的核酸分子的3’末端以延伸茎环从而产生多个经延伸的经条形码化的核酸分子(每个经延伸的经条形码化的核酸分子包含分子标记和分子标记的互补体)时，多个经条形码化的核酸分子中至少一个可以与固体支持物相关联。固体支持物可以包含合成颗粒。固体支持物可包含平坦表面(例如载玻片，例如显微镜载玻片和盖玻片)。在一些实施例中，本文描述的溶液可以分配在包含不超过一个细胞的分配区中。分配区可以包括以下中的至少之一：微滴，孔(例如，微孔)，例如在基底上的孔，或流体装置例如微流体装置的腔室。所述微滴可包含水凝胶。
19、在一些实施例中，对于本文所述的方法中的任一个，当使多个经条形码化的核酸分子中的每个之内的靶结合区和靶结合区的互补体杂交形成茎环时，多个经条形码化的核酸分子中的至少一个处于溶液中。当延伸多个经条形码化的核酸分子的3’末端以延伸茎环从而产生多个经延伸的经条形码化的核酸分子(每个经延伸的经条形码化的核酸分子包含分子标记和分子标记的互补体)时，多个经条形码化的核酸分子中至少一个可以处于溶液中。
20、在一些实施例中，对于本文所述的方法中的任一个，样品包含单细胞，所述方法包括使包含多个寡核苷酸条形码的合成颗粒与样品中的单细胞相关联合。所述方法可以包括：在将所述合成颗粒与所述单细胞相关联之后，裂解所述单细胞。裂解单细胞可以包括将样品加热、使样品与洗涤剂接触、改变样品的ph、或其任何组合。合成颗粒和单细胞可以在相同的孔中。合成颗粒和单细胞可以在相同的滴中。
21、在一些实施例中，对于本文所述的方法中的任一个，可以将多个寡核苷酸条形码中的至少一个固定在合成颗粒上。多个寡核苷酸条形码中的至少一个可以部分地固定在合成颗粒上。多个寡核苷酸条形码中的至少一个可以封闭在合成颗粒中。多个寡核苷酸条形码中的至少一个可以部分地封闭在合成颗粒中。合成颗粒可以是可破坏的。合成颗粒可以包含珠。珠可以包含交联琼脂糖(sepharose)珠、链霉亲和素珠、琼脂糖珠、磁性珠、缀合的珠、蛋白a缀合的珠、蛋白g缀合的珠、蛋白a/g缀合的珠、蛋白l缀合的珠、寡(dt)缀合的珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠或其任何组合。合成颗粒可以包含选自下组的材料，该组由以下组成：聚二甲基硅氧烷(pdms)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、硅酮、及其任何组合。合成颗粒可以包含可破坏的水凝胶颗粒。多个寡核苷酸条形码中的每一个可以包含接头官能团。合成颗粒可以包含固体支持物官能团。支持物官能团和接头官能团可以彼此相关联。接头官能团和支持物官能团可以单独地选自下组，该组由以下组成：c6、生物素、链霉亲和素、一个或多个伯胺、一个或多个醛、一个或多个酮、及其任何组合。
22、本文公开了试剂盒，其用于将寡核苷酸条形码附接至样品中的靶，确定样品中的靶数量和/或确定样品中的核酸靶数量。在一些实施例中，试剂盒包括：多个寡核苷酸条形码，其中所述多个寡核苷酸条形码中的每个包含分子标记和靶结合区，并且其中所述多个寡核苷酸条形码中的至少10个包含不同的分子标记序列；末端脱氧核苷酸转移酶或连接酶；以及缺乏5’至3’核酸外切酶活性和3’至5’核酸外切酶活性中的至少一种的dna聚合酶。试剂盒可进一步包含多个寡核苷酸，所述多个寡核苷酸包含靶结合区的互补体。包含所述靶结合区的所述互补体的所述多个寡核苷酸被配置为附接至dna分子例如cdna分子的3’末端。dna聚合酶可以包含克列诺(klenow)片段。试剂盒可包含缓冲液。试剂盒可包含柱体。试剂盒可包含用于逆转录反应的一种或多种试剂。试剂盒可包含用于扩增反应的一种或多种试剂。
23、在一些实施例中，对于本文所述的任何试剂盒或方法，靶结合区包含基因特异性序列、寡聚(dt)序列、随机多聚体、或其任何组合。寡核苷酸条形码可以包含相同的样品标记和/或相同的细胞标记。多个寡核苷酸条形码的每个样品标记和/或细胞标记可包含至少6个核苷酸。多个寡核苷酸条形码的每个分子标记可包含至少6个核苷酸。
24、在一些实施例中，对于本文所述的任何试剂盒或方法，多个寡核苷酸条形码中的至少一个固定在合成颗粒上。多个寡核苷酸条形码中的至少一个可以部分地固定在合成颗粒上。多个寡核苷酸条形码中的至少一个可以封闭在合成颗粒中。多个寡核苷酸条形码中的至少一个可以部分地封闭在合成颗粒中。合成颗粒可以是可破坏的。合成颗粒可以包含珠。珠可以包含交联琼脂糖(sepharose)珠、链霉亲和素珠、琼脂糖珠、磁性珠、缀合的珠、蛋白a缀合的珠、蛋白g缀合的珠、蛋白a/g缀合的珠、蛋白l缀合的珠、寡(dt)缀合的珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠或其任何组合。合成颗粒可以包含选自下组的材料，该组由以下组成：聚二甲基硅氧烷(pdms)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、硅酮、及其任何组合。合成颗粒可以包含可破坏的水凝胶颗粒。多个寡核苷酸条形码中的每一个可以包含接头官能团。合成颗粒可以包含固体支持物官能团。支持物官能团和接头官能团可以彼此相关联。接头官能团和支持物官能团可以单独地选自下组，该组由以下组成：c6、生物素、链霉亲和素、一个或多个伯胺、一个或多个醛、一个或多个酮、及其任何组合。
1.一种将寡核苷酸条形码附接至样品中的核酸靶的方法，所述方法包括：
2.如权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括：基于与所述多个经延伸的经条形码化的核酸分子相关联的具有不同序列的分子标记、其互补序列或其组合的数量，确定所述样品中的所述核酸靶的数量。
3.一种用于确定样品中靶的数量的方法，所述方法包括：
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中对所述多个靶的拷贝进行条形码化包括：
5.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中对所述多个靶的拷贝进行条形码化包括：
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，
7.如权利要求2-6中任一项所述的方法，
8.如权利要求2-6中任一项所述的方法，
9.一种确定样品中的核酸靶的数量的方法，所述方法包括：
10.如权利要求7-9中任一项所述的方法，其中在延伸所述多个经条形码化的核酸分子的3’末端之后，将所述分子标记与所述分子标记的互补体杂交，所述方法包括使所述多个经延伸的经条形码化的核酸分子变性，之后扩增所述多个经延伸的经条形码化的核酸分子以产生所述多个经单标记的核酸分子。
