1.本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种利用鸡卵清蛋白基因(ovalbumin 基因)进行外源蛋白大量生产的方法。
背景技术：2.重组蛋白的生产对基础科学研究、疫苗生产、临床医药应用等都具有重要价值。目前，重组蛋白的生产中常用的载体为微生物载体(如大肠杆菌、酵母)以及动物细胞载体(293t细胞)等。微生物体系可以通过构建重组蛋白表达质粒等方式，在体外进行重组蛋白的表达，进行批量化、工业化生产时，可以提高产量并降低生产成本；使用动物细胞作为载体时，可以使用过表达质粒转染、基因整合等方案，使细胞系大量生产蛋白，收集纯化后即可进行后续应用。尽管利用微生物与动物细胞进行重组蛋白的生产具有灵活、方便等优势，但这些方案常会遇到蛋白质错误折叠、微生物内毒素残留等相关问题，且在产量上仍然无法满足医药行业、工业级应用等要求。
3.利用动物作为生物反应器进行重组蛋白的生产具有非常好的应用前景。奶类、蛋类与肉类是人类主要的动物蛋白质来源，其中奶类与蛋类是通过非屠宰、可持续生产的方法进行大量获取的，因此生产这两类产品的组织(牛乳腺、鸡输卵管) 是进行重组蛋白生产的理想生物反应器。其中，由于鸡的饲养成本、生产成本、管理成本等较大型动物低，因此是进行重组蛋白生产的理想动物之一。
4.在以往利用鸡进行重组蛋白的生产中，常使用逆转录病毒的方案，在鸡胚发育的早期阶段进行整体组织的病毒感染，使鸡发育后全身组织中都含有重组蛋白的高表达，在鸡输卵管中也有相关表达，从而实现重组蛋白在鸡蛋中的生产。尽管病毒转录的方案可以实现生产，但使用的病毒方案在产品安全性、动物福利等方面具有明显劣势。随着科学水平发展，在后续的研究中发现鸡原始生殖细胞可以在体外长期培养后仍然维持良好的性腺遗传能力，因此在转基因鸡的生产中具有重要价值。因此，利用原始生殖细胞进行重组蛋白生产的方案也逐渐出现，并进行了多种重组蛋白生产的尝试，但这些研究中所生产的蛋白量仍然较低。
5.重组蛋白在鸡输卵管反应器中产量较低的原因有多种，其中蛋白的分泌性是限制产量的关键因素之一。蛋白的表达与分泌是两个不同的特性，重组蛋白在鸡输卵管中具有高表达并不代表其能分泌到细胞外成为鸡蛋的组成部分。因此，以往使用多种表达方案中多数只考虑了重组蛋白的表达量问题，而没有考虑其分泌量的问题，因此多数方案也仅适用于如ifn-b等具有一定分泌能力的蛋白。利用鸡输卵管等动物生物反应器进行非分泌型重组蛋白的生产中，需要在蛋白的两端加上分泌型的信号肽序列，帮助重组蛋白穿过载体细胞的细胞膜，从而达到分泌的目的。然而，可分泌型信号肽的研究仍然缺乏，且在诸如牛乳腺细胞、鸡输卵管上皮细胞等特殊细胞种类中并不一定具有相应的分泌效果，因此利用动物进行非分泌型重组蛋白的生产具有较高的难度。
6.针对现有利用鸡输卵管作为生物反应器进行重组蛋白生产中存在蛋白产量低的
3mg/ml左右，且这一生产特性能够在后代的基因编辑中良好维持；
23.3.本发明所建立的重组蛋白大量生产方案适用性广，同时适用于非分泌性的蛋白与分泌型的蛋白；
24.4.本发明中所生产的重组蛋白与卵清蛋白之间具有连接子连接，两个蛋白之间具有一定的空间距离，维持两个蛋白的空间距离，较好地维持其功能的独立性；
25.5.本发明利用原始生殖细胞进行基因编辑鸡的生产，基因编辑过程不使用病毒相关载体，具有较好的生物安全性。
附图说明
26.图1是本发明分离纯化后体外培养的原始生殖细胞图；
27.图2是本发明原始生殖细胞进行基因编辑的方案设计简图；
28.图3是本发明原始生殖细胞形态图，其中a为基因编辑后原始生殖细胞形态图，b为流式分选富集后的原始生殖细胞形态图；
29.图4是进行基因编辑鸡的生产后，基因编辑鸡蛋清中非分泌型重组蛋白 egfp表达结果图；
30.图5是基因编辑鸡在交配2代后生产egfp重组蛋白的产量图。
具体实施方式
31.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施条例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
32.实施例：
33.1.材料准备
34.试验所使用种蛋来源于广东五黑鸡，广西三黄鸡；实际操作中可使用本地地方鸡种蛋进行。
35.2.方法
36.通过快速分离培养鸡原始生殖细胞，在原始生殖细胞中对鸡内源性卵清蛋白基因位点的编辑，用(eaaak)n及其它具有连接效应的氨基酸片段等连接子将外源蛋白基因整合到鸡卵清蛋白任意一个外显子的3’端位置，将外源基因与卵清蛋白基因融合，并将基因编辑后的原始生殖细胞移植到受体鸡胚内，待受体鸡性成熟后，与野生型即未进行基因编辑的母鸡交配产生基因编辑鸡；在基因编辑鸡开始产蛋后，“卵清蛋白-连接子-外源蛋白”的融合蛋白将在基因编辑鸡的输卵管中一起分泌，实现外源蛋白在鸡蛋中的大量生产；在生产基因编辑鸡后，可通过维持卵清蛋白基因编辑公鸡的存活达到维持外源蛋白生产鸡群，其具体过程如下所示。
37.2.1鸡性腺原始生殖细胞的快速分离与建系；
38.原始生殖细胞的分离与体外培养采用现有技术，在进行原始生殖细胞的分离与培养扩增后，可将细胞进行液氮冻存待用。
39.2.2鸡原始生殖细胞中的鸡卵清蛋白基因进行基因编辑与纯化
40.在完成鸡原始生殖细胞的分离后，在体外培养14-20天期间进行基因编辑，基因编
辑技术使用crispr/cas9、talen等相关技术，在进行基因编辑后的可以使用流式细胞仪对具有红色荧光的细胞进行分选与富集，并继续培养3-5天。
41.2.2.1基因编辑质粒的构建
42.a.u6-sgrna-cmv-cas9质粒的构建：
43.将sgrna的oligo片段退火后，通过t4连接的方式插入到cas9质粒(骨架为u6-sgrna-cmv-cas9)中，转化到感受态细胞后，摇菌过夜，提取质粒备用；
44.b.供体(donor)质粒的构建：
45.针对需要插入的序列设计pcr扩增引物，本实施例中插入的序列为非分泌型重组蛋白egfp，设计pcr扩增引物，以(eaaak)
3-egfp蛋白为例，所需要进行pcr的引物为：
46.egfp-insert-f:gaagccgctgctaagggatccatggtgagcaagggcgag
47.egfp-insert-r:caaagaagagaacgggaattcttacttgtacagctcgtcca
48.对需要表达的片段进行pcr扩增，然后通过gibson同源重组的方式，将pcr 片段整合到同源臂线性载体中。转化到感受态细胞、扩增、提取质粒后备用。
49.2.2.2原始生殖细胞的基因编辑与纯化
50.原始生殖细胞的基因编辑过程如下：
51.a.在基因编辑前2天，将鸡原始生殖细胞从液氮罐中取出，37℃水浴锅中迅速解冻，转移到15ml离心管中，700g离心力5分钟，去上清，将细胞移至培养液中培养2天；
52.b.基因编辑当天，对细胞进行计数，取20万细胞移至24孔板的一个孔中，用200ul培养液重悬；
53.c.基因编辑设计方案如图2所示，按以下体系配置转染液：opti-mem培养液100ul，cas9质粒2ug，sgrna质粒1ug，重组蛋白供体质粒(donor)1ug，重组蛋白供体质粒(donor)的结构为“同源臂-连接子-重组蛋白c-启动子-荧光标记-同源臂”，lipo20004ul；混匀转染液后室温静置10分钟，加入细胞中，基因编辑后原始生殖细胞形态图如图3a所示；
54.d.将细胞转移到37℃、5％co2培养箱中孵育6-8小时，孵育完成后，收集细胞，700g离心力5分钟，去上清，用1ml培养液重悬细胞，转移到12孔板中继续培养2-4天；转染后第4天，观察红色荧光表达情况，仍有红色荧光表达的pgc细胞为成功整合外源基因的细胞，pgc细胞进行移植以后在f0代受体的精子中表达发现红色荧光表达；
55.基因编辑后的纯化：基因编辑后的第2-4天，此时供体质粒中的“连接子
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重组蛋白-启动子-荧光标记”片段大部分已经成功整合到细胞基因组内，收集细胞，使用分选型流式细胞仪按照供体质粒(donor)中所含的荧光标记进行阳性细胞的分选，分选后的细胞使用1500g离心力离心10分钟后，去上清，使用培养液重悬后转移到24孔板中持续培养5-8天，流式分选富集后的原始生殖细胞形态图如图3b所示；取20万细胞进行细胞冻存，其余细胞用于受体鸡胚的移植，其分离纯化后体外培养的原始生殖细胞如图1所示。
56.2.3原始生殖细胞的移植与基因编辑鸡的生产
57.原始生殖细胞的移植：在进行原始生殖细胞纯化后的第5-8天，取1x104 的原始生殖细胞重悬于50μl的培养液中；取孵化时间50-55h的受精蛋，酒精消毒鸡蛋表面，在鸡蛋的顶端打开一个直径为0.5cm的圆孔，用直径为30μl的玻璃针吸取细胞并注射到孵化50-55h鸡胚的心脏中；注射完成后，使用封口膜将鸡蛋顶端开口封闭，转移回孵化箱继续培养；
58.基因编辑鸡的生产：在移植受体鸡胚孵化成功后，将受体鸡培养至性成熟，取公鸡
与野生型(未经基因编辑)的母鸡交配，在出生的f1代小鸡中挑出具有荧光标记的小鸡，即为基因编辑鸡后代；
59.2.4重组蛋白的采集
60.在筛选出基因编辑鸡的后代后，f1代母鸡就已经具备重组蛋白的生产能力。由于重组蛋白与卵清蛋白是融合表达的，在f1代母鸡产蛋后，收集f1代母鸡的蛋，取蛋清即为重组蛋白的初级产品，可直接用于下游工业级纯化等生产流程；在敲开鸡蛋后，使用绿色荧光激发器照射鸡蛋蛋清，可以在蛋清中看到强荧光蛋白的存在，图4a中可以看到基因编辑组的鸡蛋中含有大量的绿色荧光蛋白，而对照组中没有；图4b中可以看出，非分泌型的绿色荧光蛋白仅在鸡蛋蛋清中表达，而不在蛋黄中表达；
61.如图5所示，与对照组(wt)鸡蛋相比，经过oval位点基因编辑过的母鸡所产的鸡蛋中含有大量的egfp蛋白，每毫升蛋清中产量可达1-2mg。
62.2.5重组蛋白生产鸡群的维持
63.由于本发明中所述方案在鸡的卵清蛋白基因位点中插入了外源重组蛋白的相关序列，基因编辑鸡的产蛋中具有高浓度的重组蛋白，原有的营养成分不足以支撑胚胎的完整发育进程，因此，雌性基因编辑鸡不能用于种群维系。
64.在进行重组蛋白生产鸡群的维持时，需要对基因编辑的公鸡进行保种，在批量生产时进行有计划、方便管理的配种方案，持续生产基因编辑产蛋母鸡，以维持重组蛋白生产鸡群的存在及其生产能力。
65.如上即为本发明的实施例。上述实施例以及实施例中的具体参数仅是为了清楚表述发明验证过程，并非用以限制本发明的专利保护范围，本发明的专利保护范围仍然以其权利要求书为准，凡是运用本发明的说明书及附图内容所作的等同结构变化，同理均应包含在本发明的保护范围内。
技术特征：1.一种利用鸡卵清蛋白基因进行外源蛋白大量生产的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)鸡性腺原始生殖细胞的快速分离与建系；(2)鸡原始生殖细胞中的鸡卵清蛋白基因进行基因编辑与纯化；(3)鸡原始生殖细胞的移植与基因编辑鸡的生产；(4)重组蛋白即卵清蛋白-连接子-外源蛋白的初步采集；(5)重组蛋白即卵清蛋白-连接子-外源蛋白生产鸡的种群维持。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)基因编辑的位点为鸡卵清蛋白基因的最后一个外显子的编码区域即cds区域，也可以为任意一个外显子的编码区域；在进行外源基因插入时，通过在插入基因片段中添加同义突变的方式使其衔接到外源蛋白表达时不产生移码突变，使得重组蛋白的表达正确进行。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)基因编辑中连接卵清蛋白与外源基因连接子的最佳氨基酸序列为(eaaak)n，其中n代表数字1到5，即具体包括以下氨基酸序列：eaaak、eaaakeaaa、eaaakeaaakeaaak、eaaakeaaakeaaakeaaakeaaak、e a a a k e a a a k e a a a k e a a a k e a a a k。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)基因编辑中连接卵清蛋白与外源蛋白的连接子为任何具有连接效应的氨基酸片段。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)的具体操作为：在完成鸡原始生殖细胞的分离后，在体外培养14-20天期间进行基因编辑，基因编辑技术使用crispr/cas9、talen等相关技术，在进行基因编辑后的可以使用流式细胞仪对具有红色荧光的细胞进行分选与富集，并继续培养3-5天。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)的具体操作为：在对原始生殖细胞进行基因编辑与富集后，继续培养原始生殖细胞3-5天，以胚龄为50-55小时的鸡胚为受体，将原始生殖细胞移植到鸡胚的心脏中，放回孵化箱继续孵化至小鸡f0代出生；在f0代小鸡出生后，将f0代公鸡与野生型鸡交配，生产f1代鸡，f1代中具有红色荧光的鸡即为基因编辑鸡。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)的具体操作为：在f1代基因编辑母鸡开始产蛋后，直接收集鸡蛋上清，鸡蛋上清即含有大量重组蛋白，可直接用于下游的工业级纯化。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)的具体操作为：在进行种群维持时，维持具有荧光蛋白表达的公鸡群；在进行批量生产时，持续使用卵清蛋白基因编辑后的公鸡群与野生型的母鸡交配，从而维持基因编辑产蛋母鸡的持续生产。
技术总结本发明涉及基因工程技术领域，公开了一种利用鸡卵清蛋白基因进行外源蛋白大量生产的方法，通过对鸡内源性的卵清蛋白基因进行基因编辑，将外源基因通过任何具有链接效应的氨基酸片段的方式连接起来，使外源蛋白在鸡输卵管中与卵清蛋白一起表达与分泌，并整合到鸡蛋中，实现外源蛋白的大量生产；本发明具有生产量大、稳定高效的特征，并对非分泌性的外源蛋白也具有良好的适用性，为利用家禽批量生产外源重组蛋白提供了一个切实可行的方案。源重组蛋白提供了一个切实可行的方案。源重组蛋白提供了一个切实可行的方案。
技术研发人员：陆阳清 谢龙 黄振文 兰美玉
受保护的技术使用者：广西大学
技术研发日：2022.06.08
技术公布日：2022/11/1
