本发明属于蚕丝蛋白处理，尤其是涉及一种利用切向流超滤技术制备可控高浓度丝素蛋白溶液的方法。
背景技术：
1、蚕丝属于强度最好的天然纤维之一，蚕丝由70～80％的丝素蛋白和20～30％的丝胶蛋白组成。蚕丝蛋白除了作为传统纺织材料外，还可作为先进生物高分子聚合物材料。由于丝胶蛋白在体内会引起炎症反应，所以在作为生物材料使用前需对蚕丝进行脱胶等步骤处理。大量的研究表明，蚕丝经过脱胶等步骤后得到的丝素蛋白具有良好的生物相容性，其体内炎症反应要远低于胶原和聚乳酸等常用生物材料。作为一种理化特性优异的天然材料，丝素蛋白具有优异的生物兼容性，无论是贴附于体表还是植入体内，均不会引起生物排异反应。同时因其蛋白质属性，丝素蛋白产品在植入人体后能够在预设时间内可控降解后，被人体完全吸收。所以丝素蛋白作为一种天然高分子蛋白质在物理、电子、光学、生物、工程等学科都有着广阔的应用前景。
2、近年来，随着更多的科学家或研究人员的关注，实验室中的丝素蛋白材料也越来越得到了广泛的应用，尤其是材料科学、工程学、医学药学及先进的微机电系统加工技术等学科的交叉融合，将其制成参与人体活动的集成传感器、生物医疗器械等一系列高科技产品，比如制备成蚕丝蛋白骨钉、人工脑膜、缓释微针、心血管支架、人工骨等高端医疗器械，可广泛应用于骨科、运动科、心血管科、脑外科、整形医美等植入式医疗器械领域。潜在应用市场规模极其庞大。但是纵观各种文献或是研究成果，以上的研究成果仅仅停留在实验室阶段或是仅仅是只有做科学研究才能够承担得起的生产成本。所以走出实验室将其产品的生产放大或是大规模的放大的丝素蛋白原料的生产成为迫切的需求。
3、纵观蛋白质技术，广泛的应用于高粘度样品和胶体及脂质含量高的样品的预过滤膜澄清技术，可以取代现有过滤方法，使工艺流程更加符合工业化生产模式，更易于实现产业化。另外，膜澄清步骤可以去除初始样品中过饱和溶解条件下，未溶解的蛋白胶体颗粒，一方面可以降低后续超滤步骤中膜包的再生难度，另一方面可以提高产品的纯度和质量，使最终产品能够满足更稳定的生产和更高的质量标准，应用到更加严苛的医药及医疗等领域。
4、蛋白质处理技术属于生物大分子的浓缩技术，目的是利用物理或化学的方法，除去蛋白质溶液中的水分、离子和其它小分子物质，使单位体积内的蛋白质浓度大幅度提高。蛋白质样品经过了一系列的分离提取会导致样品的稀释，以及引入大量盐离子，而许多分析和研究都需要高浓度或高纯度的样品，所以选择合适的脱盐浓缩方法显得非常重要。大分子蛋白质常用的脱盐浓缩方法有透析法、电透析法和超滤法。透析法及电透析法耗时长，样品稀释度大，不易放大进行大规模生产，所以工业生产中应用较少。本技术发明人所在团队申请的中国专利cn102167724b公开总结过通常制备再生丝蛋白水溶液的方法如下：将蚕丝或废丝溶解在特定的溶剂中(这些特定的溶剂包括溴化锂水溶液、硫氰酸锂水溶液、硫氰酸钠水溶液、氯化钙-乙醇-水混合溶剂、硝酸钙-甲醇-水混合溶剂和溴化锂-乙醇-水混合溶剂等)，然后将丝素蛋白溶剂用透析膜或透析袋在纯水中进行透析除去溶剂小分子后，便能得到丝蛋白水溶液。由于在透析过程中半透膜的两侧存在很大的浓度差而导致很高的渗透压，因此大量水透过半透膜进入丝蛋白溶液中而使丝素蛋白浓度下降，严重时甚至会导致透析袋(膜)的破裂。用这种方法得到的再生丝蛋白溶液的浓度一般不会超过5wt％，而低浓度的再生丝蛋白溶液无论在人工纺丝的可操作性上还是在作为生产原料的储存，运输等方面都受到很大的限制。同时中国专利cn102167724b也提出了新的解决思路：通过对溶解在无机盐溶液中的丝蛋白，用水溶性聚合物的水溶液进行透析；聚合物的分子量为6,000～100,000，聚合物的浓度为5～50％的方法中，水溶性聚合物可以是聚乙二醇(peg)、聚环氧乙烷(peo)、聚乙烯醇(pva)、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)等。
5、在这些年的实际工作，此专利方法工序较多或步骤繁锁，其生产原料不可重复使用或是再循环过程中成本高昂。同时也有研究工作发明了低温冷冻干燥方法制备分子量低于80kda的丝素蛋白粉末，但是因为粉末的分子量较小，其力学性能比较差，无法承载生物材料的作为高强度材料的特性。所以通过更为简化的工艺制备高浓度的高分子量丝素蛋白原料更为急需。
技术实现思路
1、基于现有技术中缺乏简单有效的制备高浓度的高分子量丝素蛋白的工艺方法，本发明提供一种利用切向流超滤技术制备可控高浓度丝素蛋白溶液的方法。
2、本发明的方法可以规模化制备高浓度高分子量的丝素蛋白水溶液，本发明提出的丝素蛋白溶液制备方法是利用切向流超滤技术，将制备得到的丝素蛋白盐溶液经过滤膜澄清后，通过具有高流速和高通量的膜材，通过控制其压力或流速等条件来保证蛋白的分子量不降低。蛋白质溶液在一定压力下通过膜时，溶剂和小分子可透过，而大分子被截留。从而实现生物大分子尤其是丝素蛋白的脱盐和浓缩。
3、由于蚕丝本身不溶于水，因此本发明首先将蚕丝溶解于某些特定溶剂得到的丝素蛋白溶液，然后将制备得到的丝素蛋白盐溶液经过多层具有较强的澄清能力、高容污能力、较高的总通量、较宽的化学兼容性和较低的非特异性吸附等特点材质的深层预过滤器过滤，然后将过滤后的清液通过高流速、高通量、高亲水和低吸附的膜包材料，通过控制其压力或流速等条件来保证蛋白的分子量不降低。蛋白质溶液在一定压力下通过膜时，溶剂和小分子可透过，而大分子被截留。从而实现生物大分子尤其是丝素蛋白的脱盐和浓缩。
4、本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
5、本发明首先提供一种利用切向流超滤技术制备可控高浓度丝素蛋白溶液的方法，包括以下步骤：
6、s1：获得丝素蛋白的无机盐溶液；
7、s2：将丝素蛋白的无机盐溶液经过膜澄清处理；
8、s3：丝素蛋白的无机盐溶液的脱盐处理：将经过膜澄清处理后的清液通过切向流过滤系统进行过滤；
9、s4：丝素蛋白溶液浓缩，得到高分子量丝素蛋白的水溶液。
10、在本发明的一个实施方式中，步骤s1中，丝素蛋白的无机盐溶液是指数均分子量为80kda～200kda(流变方法测得)的丝素蛋白的无机盐溶液。
11、在本发明的一个实施方式中，步骤s1中，丝素蛋白的无机盐溶液的浓度为0.1％～50wt％，优选为4％～10wt％。
12、在本发明的一个实施方式中，步骤s1中，获得丝素蛋白的无机盐溶液，使用的无机盐选自溴化锂、硫氰酸钠、硫氰酸锂等。
13、在本发明的一个实施方式中，步骤s1中，获得丝素蛋白的无机盐溶液的方法为：
14、s11：脱胶，洗涤，干燥：将蚕茧与碱式碳酸盐(例如碳酸钠或碳酸氢钠等)加水混合，并加热，得到脱胶丝；然后将脱胶丝洗涤，烘干；
15、s12：溶解步骤：经过步骤s11处理后的干燥脱胶丝溶解于无机盐溶液，加热后得到含高浓度盐的丝素蛋白盐溶液。
16、在本发明的一个实施方式中，步骤s2中，进行膜澄清处理时，所使用的膜材料材质为多层玻璃纤维材质、多层细丝状聚丙烯材质、功能化聚醚砜或功能化再生纤维素材质等过滤材质，优选具有较强的澄清能力、高容污能力、较高的总通量、较宽的化学兼容性和较低的非特异性吸附等特点的材质，最优选是多层玻璃纤维材质。
17、在本发明的一个实施方式中，步骤s2中，进行膜澄清处理的工艺条件为：用泵将溶液泵入过滤器过滤，过滤器的过滤面积大于10cm2，孔径为0.1-50um。
18、在本发明的一个实施方式中，步骤s3中，将经过膜澄清处理后的清液通过切向流过滤系统进行过滤时，切向流过滤系统的膜包采用的材料为聚醚砜、再生纤维素或聚丙烯腈等过滤材质，优选具有高流速和高通量、具有天然的亲水性能，低吸附等特点的材质，最优选择是再生纤维素材质。
19、在本发明的一个实施方式中，步骤s3中，将经过膜澄清处理后的清液通过切向流过滤系统进行过滤时，切向流速为0～60l/min/m2，优选5.0l/min/m2；跨模压力为0.001～3.0bar，优选为0.15～1.5bar；在超滤过程中，加入纯水用来逐步替代丝素蛋白溶液中的溶剂，加入纯水的体积为1～10倍原盐溶液体积，优选为3-7倍原盐溶液体积，进一步优选为5倍原盐溶液体积。
20、在本发明的一个实施方式中，步骤s4中，得到的高分子量丝素蛋白的水溶液是指数均分子量为80kda～200kda(流变方法测得)的丝素蛋白的水溶液。
21、在本发明的一个实施方式中，步骤s4中，得到的高分子量丝素蛋白的水溶液的质量分数为1％～40％。
22、在本发明的一个实施方式中，步骤s4中，浓缩后将获得的丝蛋白溶液倒入容器中冷藏保存。经过浓缩得到的丝素蛋白的水溶液的浓度可以采用重量法进行标定。
23、在本发明的一个实施方式中，一种优选的利用切向流超滤技术制备可控高浓度丝素蛋白溶液的方法包括以下步骤：
24、s1：获得丝素蛋白的无机盐溶液；
25、s2：将丝素蛋白的无机盐溶液经过膜澄清处理，膜澄清实验选用的膜材是：多层玻璃纤维材质，1.2um，；
26、s3：丝素蛋白的无机盐溶液的脱盐处理：将经过膜澄清处理后的清液通过切向流过滤系统进行过滤，膜包材质是：功能化再生纤维素材质，截留孔径100kda，切向流速为5.0l/min/m2；跨模压力为0.15～1.5bar；
27、s4：丝素蛋白溶液浓缩，得到高分子量丝素蛋白的水溶液。本发明还提供采用上述方法制备得到的高浓度蚕丝蛋白溶液。
28、丝素蛋白是一种特殊的纤维状蛋白质，分子量在14-450kda范围内。蛋白在9.3m溴化锂(libr)溶液中可以充分溶解，丝素蛋白在溴化锂盐溶液中较稳定，在水溶液中对剪切力较为敏感，在较剧烈的晃动下，会产生絮状沉淀，通常是用透析法和电透析法进行脱盐浓缩。考虑到工业化规模生产丝素蛋白原料的需求，本发明将是首次将切向流超滤技术这种新的工艺方法运用在丝素蛋白的纯化中，从而获得可以真正工业上大规模化生产丝素蛋白原料的方法，以提高现有工艺的效率，并最终实现产业化。
29、超滤法是使用一种特殊的膜材对溶液中各种溶质分子进行选择性的快速过滤方法，液体在一定压力下通过膜时，溶剂和小分子可透过，而大分子被截留。而与常规的垂直过滤不同，在切向流过滤过程中，液体切向流过膜表面，流体产生的跨膜压力将部分溶液压过滤膜，截留部分则在系统中循环回流。整个过程中液体以一定流速流过滤膜表面，不断对滤膜表面进行冲刷，使得滤膜表面不会形成凝胶层。超滤法关键在于基于特殊的处理对象，进行工艺条件的选择，例如包括膜材料以及跨膜压力的选择，本发明通过对不同类型和规格的膜、流速、溶液浓度的测试，最终确定了最佳实验条件。
30、与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
31、目前再生丝素蛋白溶液的制备方法有很多种，本技术中丝素蛋白溶液采用的碳酸钠脱胶/溴化锂溶解体系可以得到高分子量的丝素蛋白溶液，根据文献(biomacromolecules,2012,14,285.)，其分子量可高于80kda。目前已报道的丝素蛋白溶液采用其他溶解体系，如氯化钙/乙醇体系，得到的分子量要远远低于80kda。高分子量丝素蛋白的溶液相较于低分子量丝素蛋白的溶液更不稳定，在室温、加热或是剪切作用下，易发生构象的转变而导致凝胶化。
32、本技术的技术贡献为：本发明研究发现丝素蛋白分子具有极易受剪切力影响发生构象转变致使其非水溶的特性，本发明利用该特性，结合超滤工艺的简易操作的特性，获得了利用切向流超滤技术制备可控高浓度丝素蛋白溶液的方法，制备了高浓度、高分子量的丝素蛋白溶液。
33、本专利申请利用切向流超滤技术制备可控的高浓度丝素蛋白溶液的一个优势在于，在较强剪切或压力下的丝素蛋白分子易发生构象转变(从可溶到不可溶)，当存在较大的剪切力或是较高压力下利用切向流技术克服外界对丝素蛋白分子的扰动。
34、本专利申请利用切向流超滤技术制备可控的高浓度丝素蛋白溶液的另一个优势在于：在丝素蛋白溶解过程用到的无机盐可以直接回收利用，因为切向流技术方法在脱盐的过程中，用1-10倍体积的纯水替换无机盐溶液，以用5倍体积的纯水替换libr溶液为例来做说明，相当于，1l 9.3m libr被稀释了5倍，实验的最终结果就是产生了5l 1.86m的libr溶液，这个溶液可以直接再加入libr，配置成9.3m的溶液继续来溶解丝素蛋白，或者通过蒸发的方式，将libr结晶出来。而传统的方法，用到了大量的纯水来透析，例如，透析200ml的9.3m libr丝素蛋白溶液需要用到48l纯水，这个体量的溶液难以再将libr回收再利用。libr的市场价比较贵，大约在150-250/kg，所以利用切向流技术方法可以大量节约成本，而且节约水资源。本专利申请的工业意义在于省去了透析除盐和透析浓缩工艺，简化了生产工艺，降低了生产成本，提高了时间效率，传统的透析方法处理1l的溶液需要3天的时间，加上用peg进行浓缩，总共需要4-5天时间，切向流的方法处理1l的溶液只需要1-2小时。因而，由此方法是可以用较低成本、较短的时间得到高子量的丝素蛋白溶液，从而为新的功能性丝素蛋白基材料的规模化制备提供可能性，进一步开拓丝素蛋白产业化的新局面。
35、本发明通过切向流技术实现对丝素蛋白盐溶液的脱盐与浓缩，从而直接得到数均分子量为80kda～200kda的丝素蛋白的水溶液。由于利用切向流技术过滤处理前通过对蛋白盐溶液进行了澄清，所得丝素蛋白无机盐溶液中的不溶物或是其他杂质均得到去除后，可以增加或是提高溶液均匀稳定透明性，所得的材料的各方面性能均有所提高。因而本发明通过基本的切向流技术过程能够得到高分子量的丝素蛋白浓缩溶液，大大提高了效率，节约了成本，为丝素蛋白材料的生产提供了更多的便捷。
1.一种利用切向流超滤技术制备可控高浓度丝素蛋白溶液的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种利用切向流超滤技术制备可控高浓度丝素蛋白溶液的方法，其特征在于，步骤s1中，丝素蛋白的无机盐溶液的浓度为0.1％～50wt％。
3.根据权利要求2所述的一种利用切向流超滤技术制备可控高浓度丝素蛋白溶液的方法，其特征在于，步骤s1中，丝素蛋白的无机盐溶液的浓度为4％～10wt％。
4.根据权利要求1所述的一种利用切向流超滤技术制备可控高浓度丝素蛋白溶液的方法，其特征在于，步骤s1中，获得丝素蛋白的无机盐溶液的方法为：
5.根据权利要求1所述的一种利用切向流超滤技术制备可控高浓度丝素蛋白溶液的方法，其特征在于，步骤s3中，将经过膜澄清处理后的清液通过切向流过滤系统进行超滤时，切向流速为5.0l/min/m2。
6.根据权利要求1所述的一种利用切向流超滤技术制备可控高浓度丝素蛋白溶液的方法，其特征在于，步骤s3中，将经过膜澄清处理后的清液通过切向流过滤系统进行超滤时，跨模压力为0.15～1.5bar。
7.根据权利要求1所述的一种利用切向流超滤技术制备可控高浓度丝素蛋白溶液的方法，其特征在于，步骤s4中，得到的丝素蛋白的水溶液的质量分数为1％～40％。
8.根据权利要求1所述的一种利用切向流超滤技术制备可控高浓度丝素蛋白溶液的方法，其特征在于，步骤s3和s4中用到的泵为动力泵，选自蠕动泵、卫生离心泵、卫生凸轮泵或隔膜泵。
