本发明涉及环境监测，特别指一种基于鱼肝脏冻干粉暴露模式的环境监测方法。
背景技术：
1、鱼肝脏粗酶液为离体的鱼肝脏匀浆破碎离心后得到的上清液，含有多种生物代谢酶和蛋白，如7-乙氧基-3-异吩噁唑酮脱乙基酶(erod)、谷胱甘肽硫-转移酶(gst)等。实验室研究发现污染物(溴代阻燃剂、多环芳烃、多氯联苯等)和细胞色素p450(如：erod等)、抗氧化酶系(如：gst、sod等)生化指标之间存在一定的剂量效应关系。
2、现有技术通常采用体内实验法(或者说是活体动物实验)来监测评估环境质量。具体操作是：采集待研究水域的鱼类活体样本，测试鱼类活体组织中的erod酶活性等参数，据此监测评估环境质量。但是，该技术需要采集现场环境的活体鱼类，且要求样本数量大，导致成本上升和动物伦理的负担。有的海域因为污染、过度捕捞等各种原因采集不到满足实验量的活体样本。而且，不同海域采集的鱼类不同，不同鱼类的酶活性因为物种差别可能存在差异，这样导致的结果：不同海域环境质量的差异被生物物种的差异所干扰，因而不能准确反映环境质量，而且活体实验操作过程也较为复杂。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种基于鱼肝脏冻干粉暴露模式的环境监测方法，对离体暴露后的鱼肝脏粗酶液的酶活性等指标进行测试，能够简单高效地监测环境质量。
2、为达成上述目的，本发明的解决方案为：一种基于鱼肝脏冻干粉暴露模式的环境监测方法，包括以下步骤：
3、s1：制备离体鱼肝脏粗酶液冻干粉固体试剂；
4、s2：采集水环境中水体或沉积物样品，通过有机相富集脂溶性污染物，制备得到样品提取液；
5、s3：取一定量的冻干粉固体试剂，溶于pbs(ph7.0～8.0),固液比(w/v)为1:100～300，配制得到粗酶液，将粗酶液制品和样品提取液按1:1(体积比)混匀，室温静置0.5～1小时，测试粗酶液中7-乙氧基-3-异吩噁唑酮脱乙基酶(erod)、谷胱甘肽硫转移酶活性(gst)的相对酶活性；
6、s4：环境样品中污染物毒性效应的评估标准：根据相对酶活性，对水环境样品提取液中污染物毒性效应进行评估，相对酶活性在80％～100％之间归为一类，相对酶活性在60％～80％之间归为二类，相对酶活性低于60％归为三类，一类至三类的环境质量依次降低。
7、优选方案，所述步骤s1包括以下步骤：
8、s1.1：从活鱼鱼体取出肝脏后，用预冷kcl溶液洗涤，滤纸吸掉血渍；称重，按1:5(w/v)的比例加入预冷的pbs(ph 7.0～8.0),冰浴下匀浆；匀浆液在0～8℃下，8000～12000g离心10～30min，取上清液，即鱼肝脏粗酶液备用；
9、s1.2：将制备得到的鱼肝脏粗酶液在-80～-40℃冰箱或液氮冻存24～72小时，至粗酶液完全冻结；
10、s1.3：将冻结的鱼肝脏粗酶液用冷冻干燥机在-80～-40℃及真空条件下干燥24～72小时至鱼肝脏粗酶液变为干燥的干粉状，得到鱼肝脏粗酶液冻干粉固体试剂，于-20～-4℃保存。
11、优选方案，所述步骤s1.1中，从活鱼鱼体取出的肝脏来自保持鲜活状态的鱼。
12、优选方案，所述步骤s1.2中，将制备得到的鱼肝脏粗酶液进行冻结前需加入冻干辅助剂甘露醇。
13、优选方案，所述步骤s2包括以下步骤：
14、s2.1：制备水体样品的提取液：量取过滤水体样品于锥形瓶中，加入正己烷，超声萃取20～40min，静止分层20～40min，将有机相转移至玻璃瓶中，氮吹至正己烷完全挥发，用dmso溶剂重新溶解萃取物，得到水体样品提取液；
15、s2.2：制备沉积物样品的提取液：称取冷冻干燥的沉积物样品于锥形瓶中，加入正己烷搅拌5～10min，超声萃取20～40min，静止分层20～40min，提取液用定性滤纸过滤至玻璃瓶中，氮吹至正己烷完全挥发，用dmso溶剂重新溶解萃取物，得到沉积物样品提取液。
16、优选方案，所述步骤s2.1和步骤s2.2中，进行超声萃取采用的萃取剂包括正己烷、丙酮、氯仿、乙酸乙酯和石油醚。
17、优选方案，所述步骤s4中，相对酶活性为样品组酶活性值/对照组酶活性值的百分比，其计算公式如下：
18、erod相对酶活性＝样品组的荧光变化速率/对照组荧光变化速率×100％；
19、其中，荧光变化速率为：在特定激发波长，特定发射波长条件下，荧光测试仪器记录测试溶液在特定时间内的荧光变化速率，单位为荧光变化值/秒；
20、gst相对酶活性＝样品组的吸光度变化速率/对照组吸光度变化速率×100％；
21、其中，吸光度变化速率为：在特定波长条件下，紫外可见吸光度测试仪器记录测试溶液在特定时间内的吸光度变化速率，单位为吸光度变化值/秒；
22、所述对照组为没有添加样品提取液的溶剂组。
23、采用上述方案后，本发明的有益效果在于：
24、1、本发明采用离体暴露的方法，以离体鱼肝脏粗酶液作为试剂，与水体环境中的水体或沉积物样品的提取液混合，通过对离体暴露后的鱼肝脏粗酶液的酶活性等指标进行测试，能够快速高效地进行污染物毒性效应研究和环境监测。
25、2、本发明中制备的鱼肝脏粗酶液冻干粉固体试剂呈海绵疏松多孔状，加水后能够快速溶解并恢复原有水溶液的理化特性和生物活性，具有较强的稳定性，可以在常温下保存较长时间，具备稳定、均一的优点，克服了传统活体检测实验结果不稳定的缺点，结果具有重复性。
26、3、本发明以鱼肝粗酶液冻干粉为作用试剂，与采集于不同站点的环境样品相作用，克服传统活体检测实验存在的不同海域环境质量的差异被生物物种的差异干扰的缺陷和不足。
27、4、本发明的鱼肝脏粗酶液冻干粉固体试剂，在实验过程所需用量较少，仅微克级别，能够有效节省材料成本。
28、5、本发明对于鱼肝脏粗酶液冻干粉固体试剂的暴露实验过程仅为0.5～1小时，能够有效减少时间成本。
1.一种基于鱼肝脏冻干粉暴露模式的环境监测方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的一种基于鱼肝脏冻干粉暴露模式的环境监测方法，其特征在于：所述步骤s1包括以下步骤：
3.如权利要求2所述的一种基于鱼肝脏冻干粉暴露模式的环境监测方法，其特征在于：所述步骤s1.1中，从活鱼鱼体取出的肝脏来自保持鲜活状态的鱼。
4.如权利要求2所述的一种基于鱼肝脏冻干粉暴露模式的环境监测方法，其特征在于：所述步骤s1.2中，将制备得到的鱼肝脏粗酶液进行冻结前需加入冻干辅助剂甘露醇。
5.如权利要求1所述的一种基于鱼肝脏冻干粉暴露模式的环境监测方法，其特征在于：所述步骤s2包括以下步骤：
6.如权利要求5所述的一种基于鱼肝脏冻干粉暴露模式的环境监测方法，其特征在于：所述步骤s2.1和步骤s2.2中，进行超声萃取采用的萃取剂包括正己烷、丙酮、氯仿、乙酸乙酯和石油醚。
7.如权利要求1所述的一种基于鱼肝脏冻干粉暴露模式的环境监测方法，其特征在于：所述步骤s4中，相对酶活性为样品组酶活性值/对照组酶活性值的百分比，其计算公式如下：
