本发明涉及纳米药物，尤其涉及ipc a61k47，更具体地涉及，一种ros响应脂质体纳米颗粒及其制备方法和应用。
背景技术：
1、卒中亦称中风，包括缺血性脑卒中和出血性脑卒中，指由于脑内血管狭窄或闭塞和血管破裂等所致的一组器质性脑血管疾病，以突然起病、迅速出现神经功能障碍作为其主要临床特征。近年来，随着社会人口老龄化进程加速，居民生活结构改变，全球卒中疾病总体呈现发病率高、致残率高、致死率高，复发率高以及并发症多的态势。毋庸置疑，卒中正严重威胁全球居民的身心健康。
2、尽管现代医疗取得了进步，但治疗脑卒中的药物开发仍然具有挑战性。与大多数其他药物发现领域相比，针对重要脑卒中的新药的失败率很高。目前有多种治疗方法，包括手术、脑深部刺激、静脉注射(iv)、口服和局部剂型以及康复治疗。然而，传统疗法有一定的局限性，由于血脑屏障的存在，只有少量药物到达大脑，疗效有限。相比之下，短期和高度侵入性的手术方法和大脑植入被认为是不安全治疗方法。因此，开发具有能穿越血脑屏障进入脑内的药物用于治疗脑卒中具有很大的前景。
3、现有专利cn202310662773.5公开了一种包覆中性粒细胞膜的聚芬戈莫德纳米前药的制备方法，设计了一种响应脑卒中组织微环境中活性氧的，由芬戈莫德聚合物“内核”和中性粒细胞膜“外壳”组成的聚合前药纳米载体用于特异性递送芬戈莫德，以对抗缺血性脑卒中局部炎症对神经系统的损伤。但其靶向效率还有待提高。
技术实现思路
1、为了解决现有技术中的问题，本发明第一方面提供了一种具有ros响应和二级靶向功能的脂质体纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：合成mlt@hb纳米颗粒，再通过smcc(4-(n-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯)接入mg1，形成mlt@hb-mg1；准备dspe-tk-peg2000-mal和rvg29混合形成dspe-tk-peg2000-rvg29，再将dspe-tk-peg2000-rvg29、mlt@hb-mg1、大豆磷脂酰胆碱、胆固醇混合，形成ros响应脂质体纳米颗粒。
2、优选的，所述的ros响应脂质体纳米颗粒的制备方法，包括以下具体步骤：
3、s1：mlt@hb纳米颗粒的合成：将hb(血红蛋白)、褪黑素溶液在缓冲液中混合，在室温下搅拌3～6h，完成后，透析除去过量的游离物质得到mlt@hb纳米颗粒；
4、s2：mlt@hb-mg1合成：将mlt@hb纳米颗粒和smcc混合，调节ph，室温搅拌45～60min，再加入mg1靶向肽，反应10～15h，透析纯化，得到mlt@hb-mg1；
5、s3：dspe-tk-peg2000-rvg29的合成：将dspe-tk-peg2000-mal和rvg29细胞靶向肽，溶解在pbs中，室温搅拌过夜，透析除去游离的rvg29细胞靶向肽，得到dspe-tk-peg2000-rvg29；
6、s4：mlt@hb-mlr合成：
7、(1)称取氢化大豆磷脂酰胆碱、胆固醇和dspe-tk-peg2000-rvg29溶于溶剂中加热溶解，得到油相；
8、(2)将混合溶液加入溶剂，得到油相；
9、(3)将mlt@hb-mg1溶于水配制水溶液，得到水相；
10、(4)将油相逐滴加入水相中，得到初乳，将初乳通过脂质体挤出仪对mlt@hb-mlr的粒径进行调控，透析超滤后，得到血红蛋白纳米颗粒mlt@hb-mlr。
11、优选的，所述s1步骤中制备原料还包括盐酸多巴胺、bsa(牛血清白蛋白)、has(人血清白蛋白)、色素蛋白中的一种或多种。
12、优选的，所述hb、褪黑素溶液中的褪黑素的质量比为(3～7)：2；进一步优选的，为5：2。
13、优选的，所述褪黑素溶液中为褪黑素乙醇溶液；所述褪黑素和乙醇的质量体积比为1：(90～110)；进一步优选的，为1：100。
14、优选的，所述s1中过滤的滤膜规格为0.22μm、0.45μm、0.8-1.0μm和1-5μm；进一步为，0.22μm。
15、优选的，所述s1中透析的时间为22～30h，进一步优选的，为24h。
16、优选的，所述s2中mlt@hb纳米颗粒和smcc的摩尔比为(1～3)：1；进一步优选的，为1：1。
17、优选的，所述s2中ph为7.0～7.5；进一步优选的，为7.2。
18、优选的，所述smcc和mg1靶向肽的摩尔比为(1～3)：1；进一步优选的，为1：1。
19、优选的，所述s3中dspe-tk-peg2000-mal和rvg29细胞靶向肽的质量比为(1～3)：1；进一步优选的，为1：1。
20、优选的，所述s3中pbs的ph为7.2-7.4。
21、优选的，所述s4中氢化大豆磷脂酰胆碱、胆固醇和dspe-tk-peg2000-rvg29的质量比为(2～4)：(1～2)：1；进一步优选的，为3：1：1。
22、优选的，所述s4中的溶剂为无水乙醇。
23、优选的，所述s4(2)中的混合溶液和溶剂的体积比为1：(2～5)；进一步优选的，为1：3。
24、优选的，所述s4(3)中水溶液的浓度为0.5～1.5mg/ml；进一步优选的，为1mg/ml。
25、优选的，所述s4(4)中油相和水相的体积比为4：(20～30)；进一步优选的，为4：25。
26、本发明中，通过hb负载褪黑素(mlt)和mg1，改善了脑部炎症环境。本发明人发现，mg1能够靶向小胶质细胞，hb血红蛋白具有良好的生物相容性，mlt具有一定的治疗炎症环境，hb、mlt与mg1及天然的梗死区域靶向性，且能够实现结合-释放氧气，为梗死区域供氧气，提高了供氧效率。
27、本发明中，通过29个氨基酸构成的细胞靶向肽rvg29，提高了脑部递送效率。本发明人发现，rvg29细胞靶向肽与脑血管内皮细胞有较强的亲和力，能够穿过血脑屏障，进入脑内发生堵塞部位，可显著提高脑部递送效率。
28、本发明第二方面提供了一种脂质体纳米颗粒的制备方法的制备得到的脂质体纳米颗粒，为mlt@hb-mlr。
29、本发明第三方面提供了一种脂质体纳米颗粒的应用，应用于制备治疗脑卒中的药物。
30、有益效果
31、1、本发明中，通过特定血红蛋白hb负载褪黑素(mlt)形成小粒径纳米颗粒(30-40nm)，并外接mg1靶向肽形成mlt@hb-mg1，再利用以ros响应性成分的脂质体包裹mlt@hb-mg1中颗粒，并外接rvg-29靶向肽，形成了一个治疗脑卒中的二级靶向纳米药物递送系统，为治疗脑卒中提供了有力的支持。
32、2、本发明中，通过29个氨基酸构成的细胞靶向肽rvg29，提高了脑部递送效率。本发明人发现，rvg29细胞靶向肽与脑血管内皮细胞有较强的亲和力，能够穿过血脑屏障，进入脑内发生堵塞部位，可显著提高脑部递送效率。
33、3、本发明中，通过hb负载褪黑素mlt和mg1，改善了脑部炎症环境。本发明人发现，mg1能够靶向小胶质细胞，hb血红蛋白具有良好的生物相容性，mlt具有一定的治疗炎症环境，hb、mlt与mg1及天然的梗死区域靶向性，且能够实现结合-释放氧气，为梗死区域供氧气，提高了供氧效率。
34、4、本发明中，选用特定的dspe-tk-peg2000-mal，既能够连接rvg-29靶向肽，又能够提高ros响应性。
35、5、本发明中，通过特定的hb、盐酸多巴胺、smcc、mg1靶向肽、dspe-peg2000-mal、rvg29通过特定的组合，形成了具有ros相应和二级靶向二级靶向脂质体纳米药物递送系统。
1.一种ros响应脂质体纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：合成mlt@hb纳米颗粒，再通过4-(n-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(smcc)接入mg1，形成mlt@hb-mg1；准备dspe-tk-peg2000-mal和rvg29混合形成dspe-tk-peg2000-rvg29，再将dspe-tk-peg2000-rvg29、mlt@hb-mg1、大豆磷脂酰胆碱、胆固醇混合，形成脂质体纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的ros响应脂质体纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下具体步骤：
3.根据权利要求2所述的ros响应脂质体纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述s1步骤中制备原料还包括盐酸多巴胺、bsa、has、色素蛋白中的一种或多种。
4.根据权利要求2所述的ros响应脂质体纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述hb、褪黑素溶液中的褪黑素的质量比为(3～7)：2。
5.根据权利要求2所述的ros响应脂质体纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述s2中mlt@hb纳米颗粒和smcc的摩尔比为(1～3)：1。
6.根据权利要求2所述的ros响应脂质体纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述smcc和mg1靶向肽的摩尔比为(1～3)：1。
7.根据权利要求2所述的ros响应脂质体纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述s3中dspe-tk-peg2000-mal和rvg29细胞靶向肽的质量比为(1～3)：1。
8.根据权利要求2所述的脂质体纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述s4中氢化大豆磷脂酰胆碱、胆固醇和dspe-tk-peg2000-rvg29的质量比为(2～4)：(1～2)：1。
9.一种根据权利要求1～8任一项所述的ros响应脂质体纳米颗粒的制备方法制备得到的脂质体纳米颗粒。
10.一种根据权利要求9所述的ros响应脂质体纳米颗粒的应用，其特征在于，应用于制备治疗脑卒中的药物。
