本发明涉及生物医疗，尤其涉及一种特发性弱精症尿液生物标志物。
背景技术：
1、男性不育的临床表现比较多样且相应发病机理非常复杂，其中弱精症是导致男性不育的一个主要病因。弱精症可根据其发生程度不同划分为轻度、中度和重度。不同严重程度的弱精症最多可导致男性不育病例的80％。特发性弱精症(idiopathicasthenospermia，ias)是弱精症患者中一种特殊的临床表型群体，其临床表现为单纯的精子活力低下，而遗传因素、生殖系统器质性疾病、生殖内分泌、精液浓度等其他临床指标参数与正常男性一致。特发性弱精症诊断标准为男方依据《who人类精液检验与处理实验室手册第五版》进行2次及以上精液常规分析，前向运动精子百分率＜32％，精子浓度＞15×106/ml，正常形态精子百分率＞4％，且排除无精子症、生殖系统解剖异常、精索静脉曲张、感染、外伤手术、肿瘤、内分泌、高血压和肥胖等系统性疾病，以及染色体核型异常及y染色体微缺失的男性。但是目前ias患者精子活力低下的调控机制尚不清楚，ias的发病原因不明，导致临床上无法有针对性地对患者进行诊疗。
2、代谢组学(metabonomics/metabolomics)是效仿基因组学和蛋白质组学的研究思想，对生物体内所有代谢物进行定量分析，并寻找代谢物与生理病理变化的相对关系的研究方式，是系统生物学的组成部分。基因组学和蛋白质组学分别从基因和蛋白质层面探寻生命的活动，而实际上细胞内许多生命活动是发生在代谢物层面的，如细胞信号释放(cellsignaling)，能量传递，细胞间通信等都是受代谢物调控的。代谢物则更多地反映了细胞所处的环境，这又与细胞的营养状态，药物和环境污染物的作用，以及其他外界因素的影响密切相关。代谢组学的主要技术手段是核磁共振(nmr)，质谱(ms)，色谱(hplc，gc)及色谱质谱联用技术。通过检测一系列样品的nmr谱图，再结合模式识别方法，可以判断出生物体的病理生理状态，并有可能找出与之相关的生物标志物(biomarker)。由此通过对机体代谢产物的深入研究，就可以判断机体是否处于正常状态。但是目前还未见有通过代谢组学去找寻用于男性特发性弱精症早期诊断的生物标志物的研究报道，现有报道的可用于诊断的尿液生物标志物也未涉及特发性弱精症或精子活力相关。
技术实现思路
1、本发明所要解决的技术问题在于，提供一种特发性弱精症尿液生物标志物的应用及其检测方法。
2、为了解决上述技术问题，作为本发明的第一个方面，本发明提供了一种特发性弱精症尿液生物标志物，其为4'-磷酸泛烯基半胱氨酸(4'-phosphopantothenoylcysteine，cas：7196-09-0)、11-羟基-14,15-环氧二十碳三烯酸(11h-14,15-eeta，cas：219535-29-2)、15酮-前列腺素f2a(15-keto-prostaglandin f2a，cas：35850-13-6)中的一种或多种。
3、本发明基于代谢组学，研究分析正常男性和特发性弱精症患者之间的特征性差异代谢物，最终获得了特发性弱精症早期诊断尿液生物标志物：4'-磷酸泛烯基半胱氨酸(4'-phosphopantothenoylcysteine，cas：7196-09-0)、11-羟基-14,15-环氧二十碳三烯酸(11h-14,15-eeta，cas：219535-29-2)、15酮-前列腺素f2a(15-keto-prostaglandin f2a，cas：35850-13-6)。这些标志物的灵敏度及特异度均大于0.9，曲线下面积(auc)均大于等于0.9，提示这三个指标预测性较好，可用于特发性弱精症的早期诊断。
4、作为本发明的第二方面，本发明提供了特发性弱精症尿液生物标志物在制备用于检测特发性弱精症的试剂盒中的用途，所述特发性弱精症尿液生物标志物为4'-磷酸泛烯基半胱氨酸、11-羟基-14,15-环氧二十碳三烯酸、15酮-前列腺素f2a中的一种或多种。
5、作为本发明的第三个方面，本发明提供了用于检测特发性弱精症尿液生物标志物的试剂在制备用于检测特发性弱精症的试剂盒中的用途，所述特发性弱精症尿液生物标志物为4'-磷酸泛烯基半胱氨酸、11-羟基-14,15-环氧二十碳三烯酸、15酮-前列腺素f2a中的一种或多种。
6、作为本发明的第四个方面，本发明提供了特发性弱精症尿液生物标志物在制备或筛选用于治疗特发性弱精症的药物中的用途，所述特发性弱精症尿液生物标志物为4'-磷酸泛烯基半胱氨酸、11-羟基-14,15-环氧二十碳三烯酸、15酮-前列腺素f2a中的一种或多种。
7、作为本发明的第五个方面，本发明提供了一种用于检测特发性弱精症的试剂盒，其包括用于检测特发性弱精症尿液生物标志物的试剂，所述特发性弱精症尿液生物标志物为4'-磷酸泛烯基半胱氨酸、11-羟基-14,15-环氧二十碳三烯酸、15酮-前列腺素f2a中的一种或多种。该试剂盒可通过检测上述的一种或多种标志物的浓度，以判断受试者是否患有特发性弱精症。
8、作为本发明的第五个方面，本发明还提供了一种检测特发性弱精症尿液生物标志物的方法，其包括以下步骤：
9、将待测尿液采用提取溶剂提取，得到供试品溶液；
10、采用液相色谱-质谱联用仪测定所述供试品溶液，即得；
11、其中，所述提取溶剂为乙腈和甲醇的混合物，乙腈和甲醇的体积比为1:1～3:3；
12、所述液相色谱-质谱联用仪的色谱条件包括：以乙腈和水的混合溶液为流动相a，以乙腈、异丙醇和水的混合物为流动相b；流动相a中乙腈和水的体积比为90:10～99:1，流动相b中乙腈、异丙醇和水的体积比为40:40:3～50:50:8；
13、所述液相色谱-质谱联用仪的质谱条件包括，质量扫描范围为m/z 70～1050；
14、其中，所述特发性弱精症尿液生物标志物为4'-磷酸泛烯基半胱氨酸、11-羟基-14,15-环氧二十碳三烯酸、15酮-前列腺素f2a中的一种或多种。
15、作为上述技术方案的改进，所述将所述待测尿液采用提取溶剂提取，得到供试品溶液的步骤中，将待测尿液与提取溶剂以1:3～1:5的体积比混合，在3℃～10℃下采用频率为20khz～50khz的超声提取10min～60min，然后在-30℃～-10℃静置10min～50min，离心后取上清液，并干燥得到固相，将所述固相采用复溶液溶解，在3℃～10℃下采用频率为20khz～50khz的超声萃取2min～10min，离心后取上清液，即得供试品溶液；
16、其中，所述提取溶剂中含有0.01mg/ml～0.1mg/ml的l-2-氯苯丙氨酸；所述复溶液为乙腈和甲醇的混合物，乙腈和甲醇的体积比为1:1～3:3。
17、作为上述技术方案的改进，所述流动相a中乙腈和水的体积比为95:5，且流动相a中含有0.1vol％甲酸；
18、所述流动相b中乙腈、异丙醇和水的体积比为47.5:47.5:5；且流动相b中含有0.1vol％甲酸。
19、作为上述技术方案的改进，所述液相色谱-质谱联用仪的色谱条件还包括：
20、所述色谱-质谱联用仪的色谱柱以十八烷基键合硅胶为填充剂，其柱长为50mm～250mm，柱径为1mm～3mm，填充剂的粒径为1.7μm～3μm；
21、进样量为1μl～5μl，流速为0.1ml/min～1ml/min，柱温为30℃～45℃。
22、作为上述技术方案的改进，所述液相色谱-质谱联用仪的色谱条件还包括：
23、采用正负离子扫描模式，鞘气流速为30psi～80psi，辅助气流速为10psi～20psi，辅助气加热温度为400℃～450℃，正离子模式离子喷雾电压为3000v～4000v，负离子模式离子喷雾电压为-4000v～-3000v，离子传输管温度为320℃～350℃，归一化的碰撞能为20-40-60v循环碰撞能，一级质谱分辨率50000～70000，二级质谱分辨率6000～8000，采用dda模式采集数据。
24、作为上述技术方案的改进，所述液相色谱-质谱联用仪的色谱条件还包括：
25、所述色谱-质谱联用仪的色谱柱为waters xselect hss t3色谱柱，其柱长为100mm，柱径为2.1mm，其填充相的粒径为1.8μm；
26、进样量为3μl，流速为0.4ml/min，柱温为40℃；
27、所述液相色谱-质谱联用仪的色谱条件还包括：
28、采用正负离子扫描模式，鞘气流速为50psi，辅助气流速为13psi，辅助气加热温度为425℃，正离子模式离子喷雾电压为3500v，负离子模式离子喷雾电压为-3500v，离子传输管温度为325℃，归一化的碰撞能为20-40-60v循环碰撞能，一级质谱分辨率60000，二级质谱分辨率7500，采用dda模式采集数据。
29、作为本发明的第六个方面，本发明还提供了上述特发性弱精症标志物的筛选方法，其包括：
30、(1)选取健康男性及特发性弱精子症男性各10人。特发性弱精子症诊断标准为进行2次及以上精液常规分析，前向运动精子百分率＜32％，精子浓度＞15×106/ml，正常形态精子百分率＞4％，且排除无精子症、生殖系统解剖异常、精索静脉曲张、感染、外伤手术、肿瘤、内分泌、高血压和肥胖等系统性疾病，以及染色体核型异常及y染色体微缺失的男性。
31、(2)吸取100μl液体样本于1.5ml离心管中，加入400μl提取液(乙腈：甲醇＝1：1)含0.02mg/ml的内标(l-2-氯苯丙氨酸)，涡旋混匀30s后，低温超声提取30min(5℃，40khz)，将样品静置于-20℃，30min。4℃，13000g离心15min，移取上清液，氮气吹干，100μl复溶液(乙腈：水＝1:1)复溶，低温超声萃取5min(5℃，40khz)，4℃，13000g离心10min，移取上清液至带内插管的进样小瓶中上机分析。
32、(3)使用超高效液相色谱串联傅里叶变换质谱uhplc-q exactive hf-x系质谱法检测供试品溶液，获得30个尿液样本的指纹图谱(具体测试条件如上部分所述)。
33、(4)通过数据前处理、多元统计分析并筛选差异代谢物，将这些差异代谢物的精确分子量与网络数据库进行比对，最终获得所述的基于代谢组学的男性特发性弱精症早期诊断尿液生物标志物。
34、实施本发明，具有如下有益效果：
35、1、本发明提供了用于男性特发性弱精症早期诊断的尿液生物标志物，所述尿液生物标志物为4'-磷酸泛烯基半胱氨酸(4'-phosphopantothenoylcysteine)、11-羟基-14,15-环氧二十碳三烯酸(11h-14,15-eeta)、15酮-前列腺素f2a(15-keto-prostaglandinf2a)中的一种或多种，所述标志物的灵敏度及特异度均大于0.9，曲线下面积(auc)均大于等于0.9，表明这三个指标预测性较好，可用于男性特发性弱精症早期诊断。
36、2、本发明通过超高效液相色谱串联质谱技术对男性尿液进行代谢组学分析，对所有样本中物质的峰的响应强度数据进行模型构建及判别分析，从而发现正常男性和特发性弱精症男性之间的特征性差异代谢物，并进一步分析特征性差异代谢物的含量变化，找到由特发性弱精症引起的特异性差异代谢产物，即特发性弱精症的早期诊断分子标志物。本发明所提供的方法具有无创、方便快捷的特点，并且能够准确反映特发性弱精症男性与正常男性的代谢谱差异，特异性高。
1.特发性弱精症尿液生物标志物在制备用于检测特发性弱精症的试剂盒中的用途，其特征在于，所述特发性弱精症尿液生物标志物为4'-磷酸泛烯基半胱氨酸、11-羟基-14,15-环氧二十碳三烯酸、15酮-前列腺素f2a中的一种或多种。
2.用于检测特发性弱精症尿液生物标志物的试剂在制备用于检测特发性弱精症的试剂盒中的用途，其特征在于，所述特发性弱精症尿液生物标志物为4'-磷酸泛烯基半胱氨酸、11-羟基-14,15-环氧二十碳三烯酸、15酮-前列腺素f2a中的一种或多种。
3.特发性弱精症尿液生物标志物在制备或筛选用于治疗特发性弱精症的药物中的用途，其特征在于，所述特发性弱精症尿液生物标志物为4'-磷酸泛烯基半胱氨酸、11-羟基-14,15-环氧二十碳三烯酸、15酮-前列腺素f2a中的一种或多种。
4.一种用于检测特发性弱精症的试剂盒，其特征在于，包括用于检测特发性弱精症尿液生物标志物的试剂，所述特发性弱精症尿液生物标志物为4'-磷酸泛烯基半胱氨酸、11-羟基-14,15-环氧二十碳三烯酸、15酮-前列腺素f2a中的一种或多种。
5.一种检测特发性弱精症尿液生物标志物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.如权利要求5所述的检测特发性弱精症尿液生物标志物的方法，其特征在于，所述将所述待测尿液采用提取溶剂提取，得到供试品溶液的步骤中，将待测尿液与提取溶剂以1:3～1:5的体积比混合，在3℃～10℃下采用频率为20khz～50khz的超声提取10min～60min，然后在-30℃～-10℃静置10min～50min，离心后取上清液，并干燥得到固相，将所述固相采用复溶液溶解，在3℃～10℃下采用频率为20khz～50khz的超声萃取2min～10min，离心后取上清液，即得供试品溶液；
7.如权利要求5所述的检测特发性弱精症尿液生物标志物的方法，其特征在于，所述流动相a中乙腈和水的体积比为95:5，且流动相a中含有0.1vol％甲酸；
8.如权利要求5所述的检测特发性弱精症尿液生物标志物的方法，其特征在于，所述液相色谱-质谱联用仪的色谱条件还包括：
9.如权利要求5所述的检测特发性弱精症尿液生物标志物的方法，其特征在于，所述液相色谱-质谱联用仪的色谱条件还包括：
10.如权利要求5所述的检测特发性弱精症尿液生物标志物的方法，其特征在于，所述液相色谱-质谱联用仪的色谱条件还包括：
