本发明涉及一种植物乳杆菌的筛选和应用，尤其涉及一种高产胞外叶酸的植物乳杆菌及其筛选方法和应用。
背景技术：
1、叶酸是人体需要从外界摄取的一种维生素。乳酸菌是公认的可食用微生物，已经有不少研究证明，乳酸菌具有合成天然叶酸的能力。将具有高产叶酸能力的乳酸菌应用于发酵产品，不仅能将乳酸菌自身的益生功能赋予产品，同时也能提高产品中天然叶酸的含量。
2、乳酸菌是指能发酵糖类物质并产生乳酸的无芽孢、革兰氏阳性细菌，乳杆菌属是常见的种属，在2022年发布的《可用于食品的菌种名单》中，有植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、副干酪乳杆菌、罗伊氏乳杆菌等。
3、目前筛选高产胞外叶酸乳酸菌的方法主要是将菌株接种至无叶酸培养基中发酵后检测菌株的生长情况叶酸产量，但此方法筛选的乳酸菌可能无法在含有叶酸的培养基中过量生产叶酸。由于大多数的天然食物中都含有少量的叶酸，而企图通过乳酸菌提高食物的叶酸含量并研制发酵食品，则需要筛选出可在含有少量叶酸的培养基中过量生产胞外叶酸的乳酸菌。此前杨海珠等从23株乳酸菌中筛选筛选到的2株双歧杆菌在无叶酸培养基中具有产胞外叶酸能力，而这两株菌在牛乳中混合发酵结束后，牛乳的叶酸含量与未发酵时相比差异不大，并且未对两株菌的安全性进行评估。
技术实现思路
1、发明目的：本发明的目的是提供一种植物乳杆菌的筛选方法，解决如何获得可在含有叶酸的底物中过量生产叶酸的植物乳杆菌。本发明的另一目的在于提供一种在无叶酸培养基中生长良好且胞外叶酸产量较高的菌株。本发明的第三目的在于提供一种植物乳杆菌在发酵豆蛋白制品中的应用，解决如何制备发酵豆蛋白制品的问题。
2、技术方案：本发明所述的一种植物乳杆菌的筛选方法，包括如下步骤：
3、(1)将在无叶酸培养基中能够胞外产叶酸的植物乳杆菌菌株接种至含叶酸的培养基中，培养后测定od600和胞外叶酸产量；
4、(2)以胞外叶酸产量大于3μg/100ml为标准，筛选得到高产胞外叶酸的植物乳杆菌。
5、优选地，在步骤(1)中，所述含叶酸的培养基中初始叶酸浓度为2μg/100ml至10μg/100ml。
6、优选地，在步骤(1)中，od600的值不低于0.8。
7、本发明系统地建立起高产胞外叶酸植物乳杆菌的高效筛选方法，通过定量控制培养基中叶酸初始浓度的方式筛选得到两株胞外叶酸产量较高的发明菌株，并通过发酵豆乳验证此理论的实际效果，发现可将豆乳的叶酸含量提高约两倍。
8、本发明另一方面提供一种由上述筛选方法筛得的植物乳杆菌，所述菌株的保藏名称为：grx1202，保藏编号为cgmcc no：31049，该菌株于2024年6月24日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心；或grx1201，保藏编号为cgmcc no：31048，该菌株于2024年6月24日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心。保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
9、上述两株菌溶血活性测定为不溶血，氨基酸脱羧酶活性为阴性；grx1202对庆大霉素、氯霉素、氨苄西林、头孢唑啉、利福平和复方新诺明等敏感，对四环素、红霉素和克林霉素等中度敏感，对万古霉素、青霉素和环丙沙星等耐药；grx1201对四环素、氯霉素、红霉素、氨苄西林、头孢唑啉、复方新诺明和克林霉素等敏感，对庆大霉素和利福平等中度敏感，对万古霉素、青霉素和环丙沙星等耐药。上述表明两株菌均为安全菌株。
10、本发明进一步将上述植物乳杆菌应用在发酵豆蛋白制品中。
11、优选地，所述豆蛋白制品为豆乳或豆植物基混合乳。
12、应用上述植物乳杆菌发酵豆蛋白制品的方法包括如下步骤：
13、(1)将grx1202和/或grx1201活化后接种至大豆蛋白水溶液中；
14、(2)发酵培养至豆乳呈酸性后冷藏得到发酵豆乳产品。
15、优选地，在步骤(1)中，grx1202和grx1201活化后按照活菌数1-10：1-10混合后接种至豆乳中，接种量为3％至6％。
16、优选地，在步骤(2)中，发酵培养的条件为36℃至38℃发酵至豆乳的ph为4.5时终止发酵，冷藏的条件为3℃至5℃冷藏8h至16h。
17、本发明还提供一种含有上述grx1202和/或grx1201的益生菌粉。
18、将上述乳酸菌液冷冻至-40℃至-60℃，冻干后制成粉末状即为益生菌粉，可将该粉末加入各种饮品或者食物中作为补充剂，也可应用于药品中。
19、本发明通过定量控制培养基中的叶酸初始浓度，确定菌株可过量生产胞外叶酸的叶酸初始浓度范围，并筛选出胞外叶酸产量最高的菌株。将筛选出来的菌株应用于发酵豆乳，豆乳的叶酸含量得到提高，验证了此方法的可行性，这为乳酸菌叶酸合成机制的研究提供一定的技术和方法支撑。
20、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：
21、(1)本发明通过筛选获得两株可在无叶酸培养基中产胞外叶酸和在含有叶酸培养基中过量产胞外叶酸的植物乳杆菌，两株菌可在叶酸初始浓度为4μg/100ml的培养基中过量生产叶酸，grx1202的产量为10.47μg/100ml、grx1201的产量为9.01μg/100ml。
22、(2)本发明中的菌株经鉴定均为安全菌株，可用于制备发酵乳，特别是发酵豆乳、豆植物基发酵混合乳，也可用于制备益生菌粉，应用于食品及药品中。
23、(3)本发明采用两株菌混合发酵豆乳，发酵10h后可使叶酸初始含量为8.54μg/100ml的豆乳叶酸含量提高至18.45μg/100ml，酸度达到68°t，活菌数达到4.66×108cfu/ml，持水力70.1％，粘度为3553mpa·s，硬度为0.410n，具有较好的产酸特性、生长特性及质构特性和较高的叶酸含量。
1.一种植物乳杆菌的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述植物乳杆菌的筛选方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述含叶酸的培养基中初始叶酸浓度为2μg/100ml至10μg/100ml。
3.根据权利要求1所述植物乳杆菌的筛选方法，其特征在于，在步骤(1)中，od600的值不低于0.8。
4.一种由权利要求1-3任一项所述筛选方法筛得的植物乳杆菌，其特征在于，所述菌株的保藏名称为：grx1202，保藏编号为cgmcc no：31049，该菌株于2024年6月24日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心；或grx1201，保藏编号为cgmcc no：31048，该菌株于2024年6月24日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心。
5.根据权利要求4所述植物乳杆菌在发酵豆蛋白制品中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述豆蛋白制品为豆乳或豆植物基混合乳。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，在步骤(1)中，grx1202和grx1201活化后按照活菌数1-10：1-10混合后接种至豆乳中，接种量为3％至6％。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，在步骤(2)中，发酵培养的条件为36℃至38℃发酵至豆乳的ph为4.5时终止发酵，冷藏的条件为3℃至5℃冷藏8h至16h。
10.一种含有权利要求4所述grx1202和/或grx1201的益生菌粉。
