本发明涉及生物医药，更具体地，涉及一种双重靶向治疗乳腺癌的纳米粒及其制备方法和应用。
背景技术：
1、乳腺癌已成为全球女性中最常见的诊断癌症，并在癌症相关死亡中排名第五。乳腺癌的高致死率主要归因于肿瘤转移，远端转移占乳腺癌相关死亡的90％以上。因此，迫切需要设计新颖的治疗策略来阻止乳腺癌的生长和转移。在当前临床实践中，化疗药物，如阿霉素(dox)，代表了一种常用的癌症治疗方法。然而，阿霉素治疗过程中，会表现出显著的心脏毒性。不过值得欣慰的是，先前的研究已经表明，利用纳米粒子包封可以显著减少阿霉素相关的毒性。但仅仅基于纳米粒子的epr效应(被动靶向策略)，纳米粒子富集乳腺癌部位的效率并不高。
2、纳米粒子可以通过被动和主动靶向过程到达肿瘤部位。被动肿瘤靶向利用增强渗透和滞留效应，使得纳米粒子在肿瘤内循环延长。主动靶向通常对纳米粒子载体进行修饰，与对肿瘤具有高选择性和特异性的分子或抗体结合。这种主动靶向方法对将药物纳米载体定向至肿瘤组织具有巨大潜力。
3、zhang g等公开了一种基于叶酸修饰的白芨多糖负载阿霉素介导的ph响应胶束(zhang g,huang l,wu j,et al.doxorubicin-loaded folate-mediated ph-responsivemicelle based on bletilla striata polysaccharide:release mechanism,cellularuptake mechanism,distribution,pharmacokinetics,and antitumor effects-sciencedirect[j].international journal of biological macromolecules,2020,164:566-577.doi:10.1016/j.ijbiomac.2020.07.123.)具体公开了将疏水基团硬脂酸(sa)与靶向基团叶酸(fa)通过酯键偶联在白芨多糖羟基上，制备成了基于硬脂酸修饰白芨多糖(bsps-sa)的叶酸受体靶向的(fa-bsps-sa)衍生物，通过静电相互作用制备了盐酸阿霉素与胆酸钠的复合物，并将其直接包封到fa-bsp-sa胶束中，fa-bsp-sa胶束提高了dox的绝对生物利用度(p<0.01)，并延长了平均停留时间。但其采用的硬脂酸生物相容性相对较低，可能会引发一定的生物反应，且其对肿瘤的抑制率有待提高且并不具有预防和治疗乳腺癌肺转的功能。
技术实现思路
1、本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种双重靶向治疗乳腺癌的纳米粒。
2、本发明的第二个目的在于提供所述双重靶向治疗乳腺癌的纳米粒的制备方法。
3、本发明的第三个目的在于提供所述双重靶向治疗乳腺癌的纳米粒的应用。
4、本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
5、一种双重靶向治疗乳腺癌的纳米粒子，是以铁皮石斛多糖-胆固醇半琥珀酸酯两亲性共轭物(chs-dop)为药物载体包载抗乳腺癌化疗药物，药物载体表面修饰有叶酸(fa)配体。其具有被动和主动靶向功能；所述铁皮石斛多糖-胆固醇半琥珀酸酯两亲性共轭物结构式如下所示：
6、n为1～2。
7、铁皮石斛是一种传统中药，具有滋阴清热、益胃生津的功效，已经作为中药材和食疗用(如煲汤)产品应用几千年。近年来，铁皮石斛已被中国国家卫生健康委员会列为“药食同源”目录，表明其安全无毒性。在铁皮石斛的关键成分中，铁皮石斛多糖在疾病治疗中发挥着重要作用。现有技术中已经证明了铁皮石斛多糖具有抗癌活性。由于多糖具有良好的生物相容性、无副作用和易于修饰等优点，因此被广泛应用于纳米载体。铁皮石斛多糖作为载体具有天然无污染、生物相容性好、可通过正常的代谢途径分解，且具有免疫活性等优点。另外，铁皮石斛多糖自身具有抗肿瘤作用，还可以刺激dcs成熟，进而进一步增强化疗药的效果。而叶酸受体(frs)是一类细胞表面受体，在将叶酸运载入细胞中起着作用。已观察到frs在各种肿瘤细胞中过度表达，包括卵巢癌、三阴性乳腺癌、子宫内膜癌、间皮瘤、结肠癌和肺癌，而在正常细胞中表达很少。通过将纳米载体与靶向frs的配体结合，可以实现特异性细胞靶向。先前的研究还表明，在表达frs的肿瘤模型中，fa靶向药物传递载体的积聚增强。因此，利用fa配体进行表面修饰，采用主动靶向策略，可以提高纳米医学向目标肿瘤组织的传递效率。
8、本发明利用铁皮石斛多糖作为药物运输载体来增强抗肿瘤效果。铁皮石斛多糖(dop)的结构主要由甘露糖和葡萄糖组成，利用铁皮石斛的有利特性，将其作为亲水基团，并以胆固醇半琥珀酸酯(chs)作为疏水基团，形成的铁皮石斛多糖-胆固醇半琥珀酸酯(chs-dop)两亲性结合物可以包载疏水性化疗药物，具备被动靶向功能。由于胆固醇半琥珀酸酯是人体内的天然成分，胆固醇半琥珀酸酯在生物系统中具有良好的生物相容性，减少了潜在的毒性和副作用。再通过叶酸配体修饰，从而使其具有主动靶向功能，从而发挥双重靶向功能。通过fa将更多的纳米粒子运输进入乳腺癌细胞，使得化疗药物化疗免疫增强的效果进一步大大增强。所述双重靶向治疗乳腺癌的纳米粒子具有显著的功效，不仅可以抑制乳腺肿瘤生长，还可以抑制乳腺肿瘤肺部转移。
9、进一步地，所述纳米粒的大小均一，粒径为210～220nm，zeta电位为-11～-14mv。
10、进一步地，所述抗乳腺癌化疗药物为阿霉素(dox)。
11、进一步地，所述铁皮石斛多糖具有(1→4)连接的β-吡喃甘露糖和β-d-吡喃葡萄糖的主链，以及由末端吡喃甘露糖组成的支链，由甘露糖和葡萄糖按4.47:1的比例组成，平均分子量为80.32kda；所述chs-dop每七个单糖单位被一个chs单位修饰。可根据现有技术(tao s,song y,ding s,et al.dendrobium officinale polysaccharide-based carrierto enhance photodynamic immunotherapy.[j].carbohydrate polymers,2023,317:,121089.doi:10.1016/j.carbpol.2023.121089.)制备得到。
12、本发明还提供上述任一所述双重靶向治疗乳腺癌的纳米粒的制备方法，包括如下步骤：
13、s1.在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(edc·hcl)的作用下，将铁皮石斛多糖与胆固醇半琥珀酸酯反应，使铁皮石斛多糖的羟基与胆固醇半琥珀酸酯的羧基相连，形成铁皮石斛多糖-胆固醇半琥珀酸酯两亲性共轭物(chs-dop共轭物)；
14、s2.将步骤s1的铁皮石斛多糖-胆固醇半琥珀酸酯两亲性共轭物与叶酸，在edc·hcl、4-二甲氨基吡啶(dmap)作用下于有机溶剂中进行连接反应，透析、醇沉制备得到叶酸共轭的铁皮石斛多糖-胆固醇半琥珀酸酯共轭物(fa-dop-chs)；
15、s3.将抗乳腺癌化疗药物与步骤s2所述叶酸共轭的铁皮石斛多糖-胆固醇半琥珀酸酯共轭物溶解于有机溶剂中，反应，透析、离心、过滤，得到包载抗乳腺癌化疗药物的纳米粒。
16、进一步地，步骤s1中铁皮石斛多糖与胆固醇半琥珀酸酯的质量比为1.6～1.7:1。
17、进一步地，步骤s2中铁皮石斛多糖-胆固醇半琥珀酸酯两亲性共轭物与叶酸的质量比为2.2～2.3:1。
18、优选地，步骤s2和s3所述有机溶剂为二甲基亚砜(dmso)。
19、进一步地，所述抗乳腺癌化疗药物与叶酸共轭的铁皮石斛多糖-胆固醇半琥珀酸酯共轭物的重量比为1:4～6。
20、优选地，所述抗乳腺癌化疗药物与叶酸共轭的铁皮石斛多糖-胆固醇半琥珀酸酯共轭物的重量比为1:5。
21、进一步地，步骤s2所述透析为采用分子量截止值为3500da的透析袋透析。
22、进一步地，步骤s3所述透析为采用分子量截止值为5000da的透析袋透析。
23、进一步地，步骤s3所述过滤为采用0.45μm微孔膜过滤。
24、优选地，所述铁皮石斛多糖的制备方法为将热水提取后的铁皮石斛提取液用乙醇沉淀，随后用h2o2和fecl2·4h2o氧化降解，然后通过冷冻干燥得到了铁皮石斛多糖(dop)。dop的纯度为84.82％。dop由甘露糖和葡萄糖按4.47:1的比例组成，平均分子量为80.32kda。
25、本发明利用了dop的有利特性，将其作为亲水基团，并以胆固醇半琥珀酸酯(chs)作为疏水基团，形成一个两性结合物称为chs-dop。随后，合成了一个fa共轭脂质，fa-dop-chs。制备了含dox的载体，制备了fa-dop-chs@dox(简称为“fa@dox”纳米粒子(nps)。随后进行了各种表征，包括药物负载能力、临界胶束浓度(cmc)、药物释放情况、细胞摄取效率以及针对fr丰富的癌细胞(4t1和ct26细胞)和fr贫乏的正常细胞(l929细胞)的细胞毒性评估。接着，进行了体内成像实验，并评估了4t1小鼠模型中fa@dox nps的抗肿瘤和抗转移效果，以评估治疗效果。此外，还进行了生物安全性评估，并分析了体内外的免疫反应。结果显示，得到的fa@dox纳米粒子通过被动和主动靶向输送至实体肿瘤后，肿瘤细胞被释放的阿霉素杀死，并通过dop增强了免疫原性细胞死亡(icd)，促进了自然杀伤细胞(nk细胞)的增殖，促进了树突状细胞成熟，并协同调节各种免疫细胞，同时预防乳腺癌肺转移。总之，本发明制备了具有双重靶向治疗乳腺癌的乳腺癌靶向制剂，以治疗乳腺癌发生和肺转移。
26、因此，本发明还提供上述任一所述双重靶向治疗乳腺癌的纳米粒在制备治疗乳腺癌的药物制剂中的应用。
27、本发明还提供上述任一所述双重靶向治疗乳腺癌的纳米粒在制备预防和/或治疗乳腺癌肺转移的药物制剂中的应用。
28、本发明还提供一种治疗乳腺癌的药物制剂，所述药物制剂含有上述任一所述双重靶向治疗乳腺癌的纳米粒。
29、进一步地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
30、相较于zhang的研究，本发明具有以下优势：①由于胆固醇半琥珀酸酯是人体内的天然成分，胆固醇半琥珀酸酯在生物系统中具有良好的生物相容性，减少了潜在的毒性和副作用。胆固醇半琥珀酸酯相对于硬脂酸的主要优点在于其良好的生物相容性、较高的化学活性、多功能的结构刚性和调控性的疏水性。本发明所制备的纳米粒子生物相容性好，无毒副作用，具有良好的血液相容性；②本发明所制备的fa@dox纳米粒子对肿瘤的抑制率是游离dox对肿瘤抑制率的1.4倍，高于zhang的文章所报道的1.38倍；③本发明所制备的fa@dox纳米粒子可以预防和治疗乳腺癌的转移，对乳腺癌肺转移的抑制率达到54％，而zhang的文章所制备的纳米粒子不具有此类效果。④铁皮石斛作为“药食同源”目录产品，铁皮石斛多糖具有抗肿瘤、增强免疫等作用。且铁皮石斛多糖含量丰富，2020版《中国药典》规定铁皮石斛多糖含量超过25％，而《中国药典》对白及(也即白芨)的含量规定则是含1，4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯(c34h40o17)不得少于1.5％，并非多糖。且文献报道，安龙白及的多糖含量最高，达23.20％；最低的为施秉白及，仅11.70％(韩雪，曾庆鸿，牛敏敏，等,不同产地鲜品白及的多糖含量测定[j],2020,37(12):34-35.)。相对于白及多糖，铁皮石斛多糖更具有产业化潜力。
31、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
32、本发明的双重靶向治疗乳腺癌的纳米粒，是以铁皮石斛多糖-胆固醇半琥珀酸酯两亲性共轭物为药物载体包载抗乳腺癌化疗药物，药物载体表面修饰有叶酸配体。本发明通过利用具有抗肿瘤作用和免疫调节活性的dop作为载体，并结合具有主动靶向功能的叶酸配体，实现双重靶向乳腺癌，发挥化疗免疫疗法作用，同时制备的纳米粒子生物相容性好，无毒副作用，具有良好的血液相容性。将得到的fa-dop-chs@dox(“fa@dox”)纳米粒子通过被动和主动靶向输送至实体肿瘤后，肿瘤细胞被释放的阿霉素杀死，并通过dop增强了免疫原性细胞死亡(icd)，促进了自然杀伤细胞(nk细胞)的增殖，进一步刺激了树突状细胞成熟，并协同调节各种免疫细胞，发挥抗肿瘤作用，同时预防乳腺癌肺转移。与单独使用化疗相比，本发明纳米粒具有减毒增效的效果；与化疗和免疫治疗联合治疗策略相比，本发明纳米粒不用另外添加免疫佐剂或免疫检查点抑制剂，更简单。
1.一种双重靶向治疗乳腺癌的纳米粒，其特征在于，是以铁皮石斛多糖-胆固醇半琥珀酸酯两亲性共轭物为药物载体包载抗乳腺癌化疗药物，药物载体表面修饰有叶酸配体；所述铁皮石斛多糖-胆固醇半琥珀酸酯两亲性共轭物结构式如下所示：
2.根据权利要求1所述纳米粒，其特征在于，所述纳米粒的大小均一，粒径为210～220nm，zeta电位为-11～-14mv。
3.根据权利要求1所述纳米粒，其特征在于，所述抗乳腺癌化疗药物为阿霉素。
4.根据权利要求1所述纳米粒，其特征在于，所述铁皮石斛多糖具有(1→4)连接的β-吡喃甘露糖和β-d-吡喃葡萄糖的主链，以及由末端吡喃甘露糖组成的支链，由甘露糖和葡萄糖按4.47:1的比例组成，平均分子量为80..32kda。
5.权利要求1～4任一所述双重靶向治疗乳腺癌的纳米粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
6.根据权利要求5所述制备方法，其特征在于，步骤s2和s3所述有机溶剂为二甲基亚砜。
7.根据权利要求5所述制备方法，其特征在于，所述抗乳腺癌化疗药物与叶酸共轭的铁皮石斛多糖-胆固醇半琥珀酸酯的重量比为1:4～6。
8.权利要求1～4任一所述双重靶向治疗乳腺癌的纳米粒在制备治疗乳腺癌的药物制剂中的应用。
9.权利要求1～4任一所述双重靶向治疗乳腺癌的纳米粒在制备预防和/或治疗乳腺癌肺转移的药物中的应用。
10.一种治疗乳腺癌的药物制剂，其特征在于，含有权利要求1～4任一所述双重靶向治疗乳腺癌的纳米粒。
