本发明涉及微生物菌剂制备，具体涉及一种提高贝莱斯芽孢杆菌液体菌剂货架期稳定性的方法。
背景技术：
1、在现代生物技术领域，微生物菌剂因其在农业、食品、环保等领域的广泛应用而备受关注。其中，贝莱斯芽孢杆菌是一种重要的益生菌，具有抑制病原菌生长、促进植物生长、改善土壤质量等功能。然而，微生物菌剂的有效性往往受到其活菌数的稳定性和衰减速度的影响。因此，如何通过制剂配方开发，稳定活菌数、减缓活菌数衰减，是提高菌剂产品货架期的关键。
2、现有的解决方案主要是通过优化培养条件、改进保存方法等方式来提高微生物菌剂的活菌数稳定性和减缓衰减速度。尽管现有技术在一定程度上解决了上述问题，但仍存在一些问题和缺点。首先，现有的解决方案往往需要复杂的操作和高昂的成本，不利于大规模生产和应用。其次，现有的保护剂可能会对菌剂的活性产生负面影响，影响其功效。最后，现有的解决方案对活菌数的稳定性和衰减速度的改善效果有限，难以满足长时间储存的需求。
3、因此，如何通过制剂配方开发，稳定活菌数、减缓活菌数衰减，提高菌剂产品的货架期稳定性，是当前技术面临的重要挑战。
技术实现思路
1、本发明的目的在于解决如下问题：1)通过制剂配方开发，稳定贝莱斯芽孢杆菌的活菌数，提高菌剂产品的货架期稳定性；2)减缓贝莱斯芽孢杆菌活菌数的衰减速度，保证产品的长期有效性；3)在不使用复杂操作和高昂成本的前提下，提高微生物菌剂的活菌数稳定性和减缓衰减速度；4)避免保护剂对菌剂活性的负面影响，同时提高菌剂的稳定性等技术问题。
2、为了实现上述的目的，本发明采用以下技术方案。
3、本发明一方面提供一种具有提高货架期稳定性的贝莱斯芽孢杆菌液体菌剂，所述贝莱斯芽孢杆菌液体菌剂配方包括：贝莱斯芽孢杆菌发酵液；以及以贝莱斯芽孢杆菌发酵液重量计，下述重量百分含量的组分：0.05～1％山梨酸钾、0.1～3％无水亚硫酸钠、0.1～3％海藻糖、0.1～1％脱脂奶粉、0.05～2％黄原胶。
4、优选地，所述贝莱斯芽孢杆菌液体菌剂配方包括：贝莱斯芽孢杆菌发酵液；以及以贝莱斯芽孢杆菌发酵液重量计，下述重量百分含量的组分：0.1％山梨酸钾、1.5％无水亚硫酸钠、1％海藻糖、0.5％脱脂奶粉、0.2％黄原胶。
5、或者，所述贝莱斯芽孢杆菌液体菌剂配方包括：贝莱斯芽孢杆菌发酵液；以及以贝莱斯芽孢杆菌发酵液重量计，下述重量百分含量的组分：0.15％山梨酸钾、2％无水亚硫酸钠、1.5％海藻糖、1％脱脂奶粉、0.3％黄原胶。
6、其中，所述贝莱斯芽孢杆菌发酵液通过如下方法获得：
7、步骤一，种子液培养
8、选取健康的贝莱斯芽孢杆菌，将其接种到种子液培养基中，于30℃下培养20小时，得到种子液。
9、步骤二，发酵培养基预处理
10、在种子液培养过程中，制备发酵培养基，所述发酵培养基的配方为：小麦面粉30～50g/l、大豆脱脂粉20～40g/l、玉米粉1～5g/l、玉米淀粉15～30g/l、玉米浆干粉5～15g/l、骨蛋白胨0.1～5g/l、酵母粉5～15g/l、氯化钠2.5～5g/l、硫酸镁0.1～2g/l、氯化锰0.01～0.1g/l、氯化钙0.1～1g/l、磷酸二氢钾0.5～2g/l、磷酸氢二钾0.1～2g/l、聚醚类消泡剂0.5～5g/l。将发酵培养基于121℃，恒温30min灭菌，灭菌结束后温度降为30℃。
11、步骤三，贝莱斯芽孢杆菌发酵
12、将步骤二获得的发酵培养基ph调整为6.75～7.12。然后，接种1～5％的步骤一获得的种子液，调节发酵罐转速为500～700rpm，空气流量为vvm＝1～1.2，罐压为0.05～0.07mpa，开始发酵。发酵28h左右时，镜检发酵液菌体芽孢脱孢率超过95％后，发酵结束。获得贝莱斯芽孢杆菌发酵液。
13、进一步地，
14、在上述步骤一中，所述贝莱斯芽孢杆菌为本技术人在先发现并已经保藏、且已公开于中国专利申请cn202210356551.6中的贝莱斯芽孢杆菌菌株(bacillus velezensis)rjw-5-5，所述贝莱斯芽孢杆菌菌株的保藏登记号为cgmcc no.22939，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
15、在上述步骤一中，所述种子液培养基的配方为：酵母粉20～25g/l、玉米浆干粉10～15g/l、玉米淀粉10～15g/l、磷酸二氢钾0.5g/l、磷酸氢二钾0.3g/l、碳酸钙3g/l、硫酸镁0.5g/l、聚醚类消泡剂0.5g/l。优选的，所述种子液培养基的配方为：酵母粉20g/l、玉米浆干粉10g/l、玉米淀粉10g/l、磷酸二氢钾0.5g/l、磷酸氢二钾0.3g/l、碳酸钙3g/l、硫酸镁0.5g/l、聚醚类消泡剂0.5g/l。
16、在上述步骤二中，所述发酵培养基的配方优选为：小麦面粉39g/l、大豆脱脂粉28g/l、玉米粉2g/l、玉米淀粉18g/l、玉米浆干粉7g/l、骨蛋白胨0.5g/l、酵母粉9g/l、氯化钠3.7g/l、硫酸镁0.8g/l、氯化锰0.05g/l、氯化钙0.4g/l、磷酸二氢钾1g/l、磷酸氢二钾0.4g/l、聚醚类消泡剂1g/l。
17、或者，在上述步骤二中，所述发酵培养基的配方优选为：小麦面粉45g/l、大豆脱脂粉35g/l、玉米粉5g/l、玉米淀粉20g/l、玉米浆干粉10g/l、骨蛋白胨0.8g/l、酵母粉12g/l、氯化钠4g/l、硫酸镁0.9g/l、氯化锰0.1g/l、氯化钙0.8g/l、磷酸二氢钾1.5g/l、磷酸氢二钾0.8g/l、聚醚类消泡剂2g/l。
18、所述发酵培养基的制备方法可以采用本领域常规的方法。例如，将发酵培养基按30l配制，取配方量的各种原料并溶于水中搅拌均匀，加入50l发酵罐中，加水定容至28.5l(水蒸气灭菌后培养基体积为30l)。
19、在上述步骤三中，所述种子液接种量优选为1％，发酵罐转速优选为500rpm，空气流量优选为vvm＝1，罐压优选为0.05mpa。
20、本发明对所述贝莱斯芽孢杆菌液体菌剂建立了定期监测机制，每三个月对菌剂的活菌数进行一次检测，以评估菌剂产品的长期有效性。本发明在进行了至少24个月的监测中，发现贝莱斯芽孢杆菌液体菌剂中微生物存活率仍保持较高水平，活菌数基本保持稳定，活菌数下降百分比均低于4％，菌剂配方活菌数较为稳定，表现出良好的货架期稳定性。
21、本发明另一方面提供一种具有提高货架期稳定性的贝莱斯芽孢杆菌液体菌剂的制备方法，所述方法包括如下步骤：
22、步骤一，种子液培养
23、选取健康的贝莱斯芽孢杆菌，将其接种到种子液培养基中，于30℃下培养20小时，得到种子液。
24、步骤二，发酵培养基预处理
25、在种子液培养过程中，制备发酵培养基，所述发酵培养基的配方为：小麦面粉30～50g/l、大豆脱脂粉20～40g/l、玉米粉1～5g/l、玉米淀粉15～30g/l、玉米浆干粉5～15g/l、骨蛋白胨0.1～5g/l、酵母粉5～15g/l、氯化钠2.5～5g/l、硫酸镁0.1～2g/l、氯化锰0.01～0.1g/l、氯化钙0.1～1g/l、磷酸二氢钾0.5～2g/l、磷酸氢二钾0.1～2g/l、聚醚类消泡剂0.5～5g/l。将发酵培养基于121℃，恒温30min灭菌，灭菌结束后温度降为30℃。
26、步骤三，贝莱斯芽孢杆菌发酵
27、将步骤二获得的发酵培养基ph调整为6.75～7.12。然后，接种1～5％的步骤一获得的种子液，调节发酵罐转速为500～700rpm，空气流量为vvm＝1～1.2，罐压为0.05～0.07mpa，开始发酵。发酵28h左右时，镜检发酵液菌体芽孢脱孢率超过95％后，发酵结束。获得贝莱斯芽孢杆菌发酵液。
28、步骤四，贝莱斯芽孢杆菌液体菌剂制备
29、所述贝莱斯芽孢杆菌液体菌剂配方包括：步骤三获得的贝莱斯芽孢杆菌发酵液；以及以贝莱斯芽孢杆菌发酵液重量计，下述重量百分含量的组分：0.05～1％山梨酸钾、0.1～3％无水亚硫酸钠、0.1～3％海藻糖、0.1～1％脱脂奶粉、0.05～2％黄原胶。将各原料充分搅拌均匀，用磷酸调节ph为6±0.2，然后分装、密封，常温保存。
30、在本发明的上述制备方法中，其中步骤一、步骤二以及步骤三的优选技术方案如上所述。
31、优选的，在步骤四中：
32、所述贝莱斯芽孢杆菌液体菌剂配方包括：步骤三获得的贝莱斯芽孢杆菌发酵液；以及以贝莱斯芽孢杆菌发酵液重量计，下述重量百分含量的组分：0.1％山梨酸钾、1.5％无水亚硫酸钠、1％海藻糖、0.5％脱脂奶粉、0.2％黄原胶。
33、或者，所述贝莱斯芽孢杆菌液体菌剂配方包括：步骤三获得的贝莱斯芽孢杆菌发酵液；以及以贝莱斯芽孢杆菌发酵液重量计，下述重量百分含量的组分：0.15％山梨酸钾、2％无水亚硫酸钠、1.5％海藻糖、1％脱脂奶粉、0.3％黄原胶。
34、本发明另一方面还提供一种用于贝莱斯芽孢杆菌发酵的发酵培养基，通过所述发酵培养基发酵获得的发酵液或者由该发酵液制备的液体菌剂，具有较高的货架期稳定性。所述发酵培养基的配方为：小麦面粉30～50g/l、大豆脱脂粉20～40g/l、玉米粉1～5g/l、玉米淀粉15～30g/l、玉米浆干粉5～15g/l、骨蛋白胨0.1～5g/l、酵母粉5～15g/l、氯化钠2.5～5g/l、硫酸镁0.1～2g/l、氯化锰0.01～0.1g/l、氯化钙0.1～1g/l、磷酸二氢钾0.5～2g/l、磷酸氢二钾0.1～2g/l、聚醚类消泡剂0.5～5g/l。
35、优选地，所述发酵培养基的配方为：小麦面粉39g/l、大豆脱脂粉28g/l、玉米粉2g/l、玉米淀粉18g/l、玉米浆干粉7g/l、骨蛋白胨0.5g/l、酵母粉9g/l、氯化钠3.7g/l、硫酸镁0.8g/l、氯化锰0.05g/l、氯化钙0.4g/l、磷酸二氢钾1g/l、磷酸氢二钾0.4g/l、聚醚类消泡剂1g/l。
36、或者，所述发酵培养基的配方为：小麦面粉45g/l、大豆脱脂粉35g/l、玉米粉5g/l、玉米淀粉20g/l、玉米浆干粉10g/l、骨蛋白胨0.8g/l、酵母粉12g/l、氯化钠4g/l、硫酸镁0.9g/l、氯化锰0.1g/l、氯化钙0.8g/l、磷酸二氢钾1.5g/l、磷酸氢二钾0.8g/l、聚醚类消泡剂2g/l。
37、在本发明中，通过所述发酵培养基发酵获得的发酵液，或者用该发酵液制备得到的液体菌剂，具有较高的货架期稳定性。例如在进行了至少24个月的监测中，发现产品中微生物存活率仍保持较高水平，活菌数基本保持稳定，活菌数下降百分比均低于4％，表现出良好的货架期稳定性。
38、本发明通过科学实验和数据分析，优化贝莱斯芽孢杆菌发酵培养基的配方，优化贝莱斯芽孢杆菌液体菌剂的制剂配方，包括调整营养物质的比例、添加适当的稳定剂和防腐剂等，通过实验筛选，选择对贝莱斯芽孢杆菌活性影响小、稳定性高的保护剂，以避免保护剂对菌剂活性的负面影响，同时提高菌剂的稳定性，以达到稳定活菌数、减缓活菌数衰减的目的。
39、有益效果
40、与现有的技术相比，本技术方案的有益效果如下：
41、1、简化操作：本发明通过制剂配方开发，无需复杂的操作，只需按照一定的比例混合各成分即可，大大简化了生产过程，降低了生产成本，有利于大规模生产和应用。
42、2、提高稳定性：本发明的制剂配方能够有效稳定活菌数，减缓活菌数衰减，提高了菌剂产品的货架期稳定性，保证了产品质量和效果。相比于现有技术，本发明的制剂配方对活菌数的稳定性和衰减速度的改善效果更为显著，能够满足长时间储存的需求。
43、3、无负面影响：本发明的制剂配方中所使用的材料均为安全无害的，不会对菌剂的活性产生负面影响，保证了菌剂的功效。相比于现有技术中的保护剂，本发明的制剂配方更加安全可靠。
44、4、提高竞争力：由于本发明的制剂配方能够提高菌剂产品的货架期稳定性，从而降低了生产和储存成本，提高了产品质量和效果，因此，本发明的菌剂产品在市场上具有更高的竞争力。
1.一种具有提高货架期稳定性的贝莱斯芽孢杆菌液体菌剂，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌液体菌剂配方包括：贝莱斯芽孢杆菌发酵液；以及以贝莱斯芽孢杆菌发酵液重量计，下述重量百分含量的组分：0.05～1％山梨酸钾、0.1～3％无水亚硫酸钠、0.1～3％海藻糖、0.1～1％脱脂奶粉、0.05～2％黄原胶。
2.根据权利要求1所述的具有提高货架期稳定性的贝莱斯芽孢杆菌液体菌剂，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌发酵液通过如下方法获得：
3.根据权利要求2所述的具有提高货架期稳定性的贝莱斯芽孢杆菌液体菌剂，其特征在于，所述步骤一中，所述贝莱斯芽孢杆菌为贝莱斯芽孢杆菌菌株(bacillus velezensis)rjw-5-5，所述贝莱斯芽孢杆菌菌株的保藏登记号为cgmcc no.22939，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
4.根据权利要求2所述的具有提高货架期稳定性的贝莱斯芽孢杆菌液体菌剂，其特征在于，所述步骤一中，所述种子液培养基的配方为酵母粉20～25g/l、玉米浆干粉10～15g/l、玉米淀粉10～15g/l、磷酸二氢钾0.5g/l、磷酸氢二钾0.3g/l、碳酸钙3g/l、硫酸镁0.5g/l、聚醚类消泡剂0.5g/l。
5.一种具有提高货架期稳定性的贝莱斯芽孢杆菌液体菌剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
6.根据权利要求5所述的具有提高货架期稳定性的贝莱斯芽孢杆菌液体菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤一中，所述贝莱斯芽孢杆菌为贝莱斯芽孢杆菌菌株(bacillusvelezensis)rjw-5-5，所述贝莱斯芽孢杆菌菌株的保藏登记号为cgmcc no.22939，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
7.根据权利要求5所述的具有提高货架期稳定性的贝莱斯芽孢杆菌液体菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤一中，所述种子液培养基的配方为酵母粉20～25g/l、玉米浆干粉10～15g/l、玉米淀粉10～15g/l、磷酸二氢钾0.5g/l、磷酸氢二钾0.3g/l、碳酸钙3g/l、硫酸镁0.5g/l、聚醚类消泡剂0.5g/l。
8.一种用于贝莱斯芽孢杆菌发酵的发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基的配方为：小麦面粉30～50g/l、大豆脱脂粉20～40g/l、玉米粉1～5g/l、玉米淀粉15～30g/l、玉米浆干粉5～15g/l、骨蛋白胨0.1～5g/l、酵母粉5～15g/l、氯化钠2.5～5g/l、硫酸镁0.1～2g/l、氯化锰0.01～0.1g/l、氯化钙0.1～1g/l、磷酸二氢钾0.5～2g/l、磷酸氢二钾0.1～2g/l、聚醚类消泡剂0.5～5g/l。
9.根据权利要求8所述的用于贝莱斯芽孢杆菌发酵的发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基的配方为：小麦面粉39g/l、大豆脱脂粉28g/l、玉米粉2g/l、玉米淀粉18g/l、玉米浆干粉7g/l、骨蛋白胨0.5g/l、酵母粉9g/l、氯化钠3.7g/l、硫酸镁0.8g/l、氯化锰0.05g/l、氯化钙0.4g/l、磷酸二氢钾1g/l、磷酸氢二钾0.4g/l、聚醚类消泡剂1g/l。
10.根据权利要求8所述的用于贝莱斯芽孢杆菌发酵的发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基的配方为：小麦面粉45g/l、大豆脱脂粉35g/l、玉米粉5g/l、玉米淀粉20g/l、玉米浆干粉10g/l、骨蛋白胨0.8g/l、酵母粉12g/l、氯化钠4g/l、硫酸镁0.9g/l、氯化锰0.1g/l、氯化钙0.8g/l、磷酸二氢钾1.5g/l、磷酸氢二钾0.8g/l、聚醚类消泡剂2g/l。
