本发明涉及基因工程，具体地，涉及用于敲除猪rbm20基因部分保守序列的sgrna组合、猪模型和构建方法。
背景技术：
1、骨骼肌是维持人体正常活动的重要器官，在运动、支持呼吸、产热和维持体内平衡方面起着重要作用。骨骼肌功能失常是临床常见疾病之一，损伤、疾病和衰老等都是造成其功能缺陷的常见原因。如何有效治疗骨骼肌损伤、提高愈合质量、促进损伤修复过程已经成为临床研究亟待解决的难题。成体骨骼肌损伤修复主要依赖于骨骼肌卫星细胞。卫星细胞为单核细胞，位于肌膜和基底膜之间，具有很强的分化潜能，其分化能力是肌组织再生成败的关键。当骨骼肌受到损伤时，卫星细胞作为干细胞首先被激活、增殖，并分化为成肌细胞，成肌细胞融合形成肌纤维，进而修复和再生受损的肌肉组织。因而，卫星细胞的分化潜能使其成为治疗遗传性肌肉组织疾病和修复损伤骨骼肌的潜在资源。
2、rbm20位于第10号染色体的长臂，包含14个外显子，编码含1227个氨基酸的蛋白质。该蛋白质包含两个锌指结构域、一个富含谷氨酸的区域、一个富含亮氨酸的区域、一个rna结合域(rna识别基序)和一个富含精氨酸/丝氨酸的区域(rs域)。研究表明，rbm20具有调控基因的可变剪接的作用，能够调节肌节蛋白中重要功能蛋白titin的可变剪接。大量的心脏相关疾病的临床样本的研究表明rbm20的突变能导致人类扩张性心肌病。rbm20缺陷的大鼠、小鼠会发生扩张型心肌病，这与rbm20突变导致的人类扩张性心肌病高度相似。
3、然而，虽然近期研究已经将人类rbm20与扩张型心肌病(dcm)相关联，但rbm20的功能、调控和底物仍然不明朗。实际上，rbm20不仅在心肌中表达，也在骨骼肌中表达。因而关于rbm20功能的研究，需要更加全面和深入，不能仅仅局限于心肌。尤其rbm20在骨骼肌中扮演的角色非常值得探索，因为已有研究证实骨骼肌疾病患者有可能会合并心脏功能障碍，这提示我们关于骨骼肌功能的研究可能有助于心肌病治疗的突破。另外，由于猪在解剖学、生理学、遗传学和疾病进展方面与人类的高度相似性，近年来逐渐成为研究人类疾病机制的理想动物模型。
4、另外，骨骼肌功能失常是临床常见疾病之一，如何有效治疗骨骼肌系统疾病、延缓肌肉衰老萎缩、促进肌肉损伤重建是极具意义的研究方向。然而目前用于骨骼肌疾病和功能研究的模型很少，比较常用的只有mdx小鼠，即针对人类杜氏营养不良症(duchennemuscular dystrophy,dmd)的小鼠模型。因而，建立其他骨骼肌疾病模型用于骨骼肌生长发育或致病基因的功能研究显得尤为必要。
技术实现思路
1、针对上述现有技术，本发明的目的在于针对现有技术中用于骨骼肌疾病和功能研究的模型很少的问题，从而提供一种能够为肌肉系统疾病或肌肉损伤、衰老等机制的研究提供新的动物模型和更多的生物材料选择方向的用于敲除猪rbm20基因部分保守序列的sgrna组合、猪模型和构建方法。
2、为了实现上述目的，本发明提供了一种用于敲除猪rbm20基因部分保守序列的sgrna组合，所述sgrna组合包括第一sgrna和第二sgrna；且，
3、表达所述第一sgrna的dna序列的正义链如seq id no:1所示，反义链如seq idno:2所示；
4、表达所述第二sgrna的dna序列的正义链如seq id no:21所示，反义链如seq idno:22所示。
5、优选地，所述sgrna组合作用位点位于猪rbm20基因的第9外显子上。
6、本发明还提供了一种用于敲除猪rbm20基因部分保守序列的打靶质粒组合，所述打靶质粒组合通过将上述所述的第一sgrna和第二sgrna的双链dna各自与载体连接获得。
7、优选地，所述载体选自px330载体。
8、本发明还提供了一种猪胎儿成纤维基因敲除细胞，所述猪胎儿成纤维基因敲除细胞通过将如上所述的打靶质粒组合转染至猪胎儿成纤维细胞中培养，筛选后得到。
9、本发明还提供了一种功能缺陷猪模型的构建方法，所述构建方法包括：将如上所述的猪胎儿成纤维基因敲除细胞作为供体细胞，通过体细胞核移植，获得功能缺陷猪模型。
10、本发明还提供了一种功能缺陷猪模型，所述功能缺陷猪模型采用如上所述的构建方法获得。
11、优选地，所述功能缺陷猪模型为骨骼肌功能缺陷猪模型。
12、通过上述技术方案，本发明选用具有高打靶效率的sgrnar6和sgrna r10两个sgrna实现从pffs中高效敲除rbm20基因第9外显子。进而通过体细胞核移植和胚胎移植技术成功获得rbm20第9外显子敲除猪。经检测，发现rbm20基因第9外显子缺失猪均出现骨骼肌生长发育迟缓，其卫星细胞的增殖速度和分化能力也受到了严重抑制。卫星细胞的增殖和分化能力代表着骨骼肌重建的潜能。证实了本发明构建的rbm20第9外显子敲除猪可以作为骨骼肌功能缺陷的动物模型，为肌肉系统疾病或肌肉损伤、衰老等机制的研究提供了新的动物模型和更多的生物材料选择。
1.一种用于敲除猪rbm20基因部分保守序列的sgrna组合，其特征在于，所述sgrna组合包括第一sgrna和第二sgrna；且，
2.根据权利要求1所述的sgrna组合，其特征在于，所述sgrna组合作用位点位于猪rbm20基因的第9外显子上。
3.一种用于敲除猪rbm20基因部分保守序列的打靶质粒组合，其特征在于，所述打靶质粒组合通过将权利要求1所述的第一sgrna和第二sgrna的双链dna各自与载体连接获得。
4.根据权利要求3所述的打靶质粒组合，其特征在于，所述载体选自px330载体。
5.一种猪胎儿成纤维基因敲除细胞，其特征在于，所述猪胎儿成纤维基因敲除细胞通过将如权利要求3或4所述的打靶质粒组合转染至猪胎儿成纤维细胞中培养，筛选后得到。
6.一种功能缺陷猪模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：将如权利要求5所述的猪胎儿成纤维基因敲除细胞作为供体细胞，通过体细胞核移植，获得功能缺陷猪模型。
7.一种功能缺陷猪模型，其特征在于，所述功能缺陷猪模型采用如权利要求6所述的构建方法获得。
8.根据权利要求7所述的功能缺陷猪模型，其特征在于，所述功能缺陷猪模型为骨骼肌功能缺陷猪模型。
