本发明涉及富硒微生物菌剂，具体为一种富硒微生物菌剂的制作方法。
背景技术：
1、农用富硒酵素制备是将可富硒的菌种微生物与硒源经发酵转化的一系列过程，加大富硒产品开发及硒资源利用，也是解决土壤和植物补硒的安全性问题的有效途径，具有重要的经济和社会效益。
2、为了解决这一问题，农用富硒酵素的制备可选择单因素控制和多因素控制进行工艺筛选。因为供硒原料、可富硒菌种微生物、温度、糖原、原料、物料添加量等因素均对发酵产生影响，且因硒的使用量范围小，用量不当时发酵液易出现硒中毒现象，产生安全隐患，同时降低农用富硒酵素的品质。通过各因素的控制，选择适宜的制备工艺，有效降低硒的安全隐患。
3、在农用富硒酵素的制备过程中，为了提高农用富硒酵素的品质和有机硒累积能力，实现安全、优质、长效、低消耗的农用富硒酵素产品，首先要了解可富硒菌种微生物进行酵素制备的影响因素，然后利用对影响农用富硒酵素制备因素的控制研究，探索农用富硒酵素的制备工艺参数对农用富硒酵素稳定度、养分、抗氧化性、有机硒累积率的影响，并建立各因素对品质影响的模糊数学评价模型，优化其工艺参数。并对农用富硒酵素的制备工艺参数对农用富硒酵素稳定度、养分、抗氧化性、有机硒累积率的影响，并建立各因素对品质影响的模糊数学评价模型，优化其工艺参数。并对农用富硒酵素对障碍性土壤的影响机制进行验证和评价。解决通过对土壤和作物进行施用硒肥带来的安全隐患问题
技术实现思路
1、(一)解决的技术问题
2、针对现有技术的不足，本发明提供了一种富硒微生物菌剂的制作方法，以解决上述背景中提出的问题。
3、(二)技术方案
4、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种富硒微生物菌剂的制作方法，包括以下步骤：
5、两个样品菌粉(菌1、菌2)进行dna提取，提取得到两个dna样品；
6、两个dna样品进行pcr扩增，得到两个扩增后的pcr产物；
7、两个扩增后的pcr产物进行电泳检测，获取鉴定胶图并进行一代测序；
8、拼接好的序列结果在ncbi数据库中进行比对，鉴定两种菌种均为乳酸菌；
9、将两种菌使用mrs培养基扩繁，使用摇床培养活化三代并培养24h后，对菌落计数，对比发现菌2数量远远多于菌1，故选择菌2；
10、亚硒酸钠添加量分别为0、2、4、6、8、10μg/ml 37℃120rpm/min摇床培养24h对三代培养后的菌液；
11、配置含亚硒酸钠的培养液将稀释好的亚硒酸钠按量加入mrs培养基中，用高速离心机5000r/min离心10min，观察菌体颜色变化，在6μg/ml时出现少量红色单质硒渗出，5000r/min离心10min，用生理盐水清洗三次后，最后5000r/min离心20min获得最终菌体培养物，倒去上清液后，使用冻干机，得到菌粉，密封保存。
12、优选的，所述样品菌粉采用韩国东夷农社酵素菌产品，使用tsingke植物dna提取试剂盒进行提取。
13、通过以上技术方案，样品菌粉来源稳定，便于进行实验和筛选。
14、优选的，所述样品菌粉进行dna提取，包括：
15、(1)将spincolumn置于collectiontube中，加入250μ|buffer bl，
16、12000rpm/min离心1min活化硅胶膜；
17、(2)取样品菌粉干燥组织(不大于20mg)，加入液氮充分研磨。研磨后置于1.5ml离心管中，加入400μ|buffer gp1，涡旋振荡1min，65℃水浴10～30min，期间可取出颠倒混匀以充分裂解；
18、(3)加入150μ|buffer gp2，涡旋振荡1min，冰浴5min；
19、(4)12000rpm/min离心5min，将上清转移至新的离心管中；
20、(5)加入上清等体积的无水乙醇，立即充分振荡混匀，液体全部转入spin column中，12000rpm/min离心30s，弃废液；
21、(6)向spin column中加入500μ|buffer pw(使用前已加入无水乙醇)，12000rpm/min离心30s，弃废液；
22、(7)向spin column中加入500μ|wash buffer(使用前已加入无水乙醇)，12000rpm/min离心30s，弃废液；
23、(8)重复操作步骤(7)；
24、(9)将spin column放回collectiontube中，12000rpm/min离心2min，开盖晾干1min；
25、(10)取出spincolumn，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中央处加50～100μ|te buffer(65℃预热te buffer)，20～25℃放置2min，12000rpm/min离心2min，提取出dna样品。
26、通过以上技术方案，样品菌粉的dna提取流程严谨合理。
27、优选的，两个所述dna样品适量稀释后作为pcr模板，以擎科1×tse101金牌mix进行扩增。
28、通过以上技术方案，使用同一批次的pcr反应混合溶液扩增，确保pcr反应的重复性和稳定性，每次使用的反应条件保持一致，不会因为手动制备pcr反应液而引入变异。
29、优选的，两个所述dna样品扩增后得到pcr产物，扩增好的pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳(2ul样品+6ul溴酚蓝)，300v电压下12分钟，获取鉴定胶图，pcr产物使用测序引物进行一代测序(测序引物为16s-722f/16s-907r)。
30、通过以上技术方案，使用16s-722f和16s-907r测序引物进行一代测序，确保高效、准确地获取pcr产物的序列信息。
31、优选的，所述pcr产物的测序结果进行比对鉴定，包括以下步骤；
32、(1)用contigexpress拼接测序结果，并去除两端不准的部分。
33、(2)将拼接好的序列在ncbi数据库(blast.ncbi.nlm.nih.gov)中进行比对：
34、(3)鉴定：在比对结果中，一般将在ncbi上比对得到的同源性在97％以上且同源度最高的、排序靠前的、物种信息明确的物种作为鉴定的参考物种
35、菌1样本16s序列比对结果为levilactobacillus brevis(或同属)
36、菌2样本16s序列比对结果为lacticaseibacillus paracasei(或同属)。
37、通过以上技术方案，通过比对ncbi数据库进行pcr产物测序结果的鉴定，可以确保物种鉴定的准确性和可靠性，为研究提供坚实的基础和深入的理解。
38、优选的，所述菌1与菌2经鉴定均为乳酸菌，将菌1与菌2用mrs培养基在37℃，120rpm/min摇床内活化三代后，使菌种复壮，将第三代菌液放入新的培养基中培养8-10h，使其进入对数生长期，吸取1ml菌液进行倍比稀释，平板涂布10-7、10-8每个进行三次重复，放入37℃恒温培养箱培养24h后，对菌落计数，对比发现菌2数量远远多于菌1，故选择菌2，进行下一步富硒发酵。
39、通过以上技术方案，选择生长较快、数量较多的菌株进行发酵，可以在相同时间内生产更多的目标产物，提高发酵的效率和经济性。
40、优选的，所述菌2在mrs培养基中培养，配置含亚硒酸钠的培养液，将稀释好的亚硒酸钠按量加入mrs培养基中，亚硒酸钠添加量分别为0、2、4、6、8、10μg/ml，通过文献查询及具体实验操作发现，当亚硒酸钠含量为6μg/ml时，离心后有少量红色硒单质渗出，变红不明显，超过6μg/ml时，亚硒酸钠含量越高，红色硒单质渗出越多，菌体数变少，故而6μg/ml为最适加硒浓度。
41、通过以上技术方案，选择6μg/ml作为亚硒酸钠的最佳添加浓度，能够在保证菌株生长和硒代谢效率的同时，最大限度地减少可能的负面影响，确保富硒发酵过程的稳定性和有效性。
42、优选的，所述富硒微生物菌剂，包括：
43、两个样品菌粉(菌1、菌2)进行dna提取，提取得到两个dna样品；
44、两个dna样品进行pcr扩增，得到两个扩增后的pcr产物；
45、两个扩增后的pcr产物进行电泳检测，获取鉴定胶图并进行一代测序；
46、拼接好的序列结果在ncbi数据库中进行比对，鉴定两种菌种均为乳酸菌；
47、将两种菌使用mrs培养基扩繁，使用摇床培养活化三代并培养24h后，对菌落计数，对比发现菌2数量远远多于菌1，故选择菌2；
48、亚硒酸钠添加量分别为0、2、4、6、8、10μg/ml 37℃120rpm/min摇床培养24h对三代培养后的菌液；
49、配置含亚硒酸钠的培养液将稀释好的亚硒酸钠按量加入mrs培养基中，用高速离心机5000r/min离心10min，观察菌体颜色变化，在6μg/ml时出现少量红色单质硒渗出，5000r/min离心10min，用生理盐水清洗三次后，最后5000r/min离心20min获得最终菌体培养物，倒去上清液后，使用冻干机，得到菌粉，密封保存。
50、通过以上技术方案，制作方法中包含了分子生物学鉴定和选择、优势菌株的选择、富硒培养液优化和硒代谢产物的优化和收获，优化了富硒微生物菌剂的生产，从而提高了产品的质量和生物活性，适合于应用于不同领域的富硒产品制备。
51、与现有技术相比，本发明提供了一种富硒微生物菌剂的制作方法，具备以下有益效果：
52、1、该富硒微生物菌剂的制作方法，结合了分子生物学技术和微生物培养技术，制备富硒微生物菌剂，流程为：适宜菌种筛选，菌种富硒培养，菌种富硒转化率检测，菌种进行大批量发酵实验，进行大田实验和动物实验，流程合理且严谨，通过富硒微生物菌剂可对作物和动物免疫力及其他方面进行改善，提升生产质量和效率。
53、2、该富硒微生物菌剂的制作方法，适宜的制备工艺，有效降低硒的安全隐患，提高了农用富硒酵素的有机硒累积率、原料的转化利用率，大大提高农用富硒酵素的品质和应用安全性。
54、3、该富硒微生物菌剂的制作方法，明确了富硒菌种微生物对其制备农用富硒酵素的有机硒累积能力的影响，实现硒元素的安全、长效循环利用，探索富硒菌种微生物制备农用富硒酵素的影响因素实现富硒菌种微生物的高值化利用，提供绿色高品质循环生态种植环境，通过优化制备工艺，解决农业生产急缺的富硒种植的新型生态产品需求，通过农用富硒酵素发酵饲料，拓展饲料添加条件及富硒养殖应用，依据富硒菌种微生物的禀赋资源，开发制备农用富硒酵素新产品，具有巨大的市场空间和可观的经济回报率。
1.一种富硒微生物菌剂，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种富硒微生物菌剂，其特征在于：所述样品菌粉采用韩国东夷农社酵素菌产品，使用tsingke植物dna提取试剂盒进行提取。
3.根据权利要求1所述的一种富硒微生物菌剂的制作方法，其特征在于：所述样品菌粉进行dna提取，包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的一种富硒微生物菌剂，其特征在于：两个所述dna样品适量稀释后作为pcr模板，以擎科1×tse101金牌mix进行扩增。
5.根据权利要求4所述的一种富硒微生物菌剂，其特征在于：两个所述dna样品扩增后得到pcr产物，扩增好的pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳(2ul样品+6ul溴酚蓝)，300v电压下12分钟，获取鉴定胶图，pcr产物使用测序引物进行一代测序(测序引物为16s-722f/16s-907r)。
6.根据权利要求5所述的一种富硒微生物菌剂，其特征在于，所述pcr产物的测序结果进行比对鉴定，包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述的一种富硒微生物菌剂，其特征在于：所述菌1与菌2经鉴定均为乳酸菌，将菌1与菌2用mrs培养基在37℃，120rpm/min摇床内活化三代后，使菌种复壮，将第三代菌液放入新的培养基中培养8-10h，使其进入对数生长期，吸取1ml菌液进行倍比稀释，平板涂布10-7、10-8每个进行三次重复，放入37℃恒温培养箱培养24h后，对菌落计数，对比发现菌2数量远远多于菌1，故选择菌2，进行下一步富硒发酵。
8.根据权利要求7所述的一种富硒微生物菌剂，其特征在于：所述菌2在mrs培养基中培养，配置含亚硒酸钠的培养液，将稀释好的亚硒酸钠按量加入mrs培养基中，亚硒酸钠添加量分别为0、2、4、6、8、10μg/ml，通过文献查询及具体实验操作发现，当亚硒酸钠含量为6μg/ml时，离心后有少量红色硒单质渗出，变红不明显，超过6μg/ml时，亚硒酸钠含量越高，红色硒单质渗出越多，菌体数变少，故而6μg/ml为最适加硒浓度。
9.根据权利要求1所述的一种富硒微生物菌剂的制作方法，其特征在于，包括以下步骤：
