本发明涉及生物检测领域，特别是涉及一种真菌毒素aod的制备方法和鉴定方法。
背景技术：
1、由镰刀菌引起的赤霉病(fusarium headblight)是危害小麦、大麦、燕麦、玉米、水稻和黑麦等多种禾谷类作物的一种重要病害，广泛分布于北美、欧洲和亚洲等温暖潮湿地区，近年来随着全球气候变暖呈逐步蔓延之势。农作物在生长或储备过程中均可感染镰刀菌。感染镰刀菌后，不但造成作物产量下降，更重要的是产生的镰刀菌毒素直接留存累积在禾谷类籽粒中，严重威胁人畜健康。
2、燕麦镰刀菌(fusarium avenaceum)是赤霉病的病原菌之一。燕麦镰刀菌(fusarium avenaceum)是一种在北纬地区较冷条件下生长的真菌，是挪威谷物中最常见的镰刀菌。与其他几种镰刀菌一样，它可能引起镰刀菌头疫病和足腐病等植物疾病。燕麦镰刀菌的分离物已被证明可以产生抗生素y、褐腐菌素、丁烯内酯、衣孢子菌、黄精、葱蝇素、褐腐菌素c和念珠菌素。此外，先前对燕麦镰刀豆水稻培养物和燕麦镰刀豆污染谷物提取物的细胞毒性研究结果表明，该物种能够产生已知的毒性代谢物之外的其他代谢物。最近，在生物分析指导下对燕麦球菌水稻培养物进行分离，将其对猪上皮肾细胞系pk(15)的细胞毒性归因于高含量的豆科植物素和一种未知化合物，未知化合物经分析鉴定为真菌毒素aod(2-amino-14,16-dimethyloctadecan-3-ol)(uhlig s,petersen d,flaoyen a,wilkins a.2-amino-14,16-dimethyloctadecan-3-ol,a new sphingosine analogue toxin in thefungal genus fusarium.toxicon 2005,46(5):513-522.)，其化学方程式为c20h43no，结构式如图5所示。
3、鉴于真菌毒素aod在小麦等谷物和水果中存在，继而对人类和动物的安全造成严重威胁的现实，近年来，针对真菌毒素aod的分析检测、体内外毒性研究及安全性评价等己引起广泛关注，这亦对于保证我国食品卫生安全具有重要意义(solhauga,torgersen ml,holme ja,wiik-nilsen j,thiede b,eriksen gs.the fusarium mycotoxin,2-amino-14,16-dimethyloctadecan-3-ol(aod)induces vacuolization in hepg2cells.toxicology2020,433.)。
4、但是由于国内对于真菌毒素aod标准品、参考品的制备尚属空白，而且目前欧美多国遵循禁止向非澳大利亚公约组织国家出售毒素及其代谢物标准品的禁运规定，为国内有关此类毒素的相关研究设置了较大障碍。因此，亟需研发一种简便的、可有效制备真菌毒素aod及鉴定真菌毒素aod的方法。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种真菌毒素aod的制备方法和鉴定方法，以解决上述现有技术存在的问题。本发明提供了一种能够有效制备真菌毒素aod的方法，且具有简便的优势。
2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
3、本发明提供了一种真菌毒素aod的制备方法，包括以下步骤：
4、(1)采用两段式避光培养活化的燕麦镰刀菌，得到产毒培养物；
5、(2)利用甲醇水溶液萃取产毒培养物，将所得提取物氮吹至干燥，采用乙醚水溶液溶解，得到乙醚复合物；
6、(3)利用乙酸乙酯萃取乙醚复合物，将所得提取物氮吹至干燥，采用三氯甲烷溶解，得到毒素初提物；
7、(4)以1-脱氧鞘脂为参照，通过薄层色谱法分离毒素初提物中的真菌毒素aod，并通过刮板回收，得到真菌毒素aod粗提物；所述薄层色谱法采用的展开剂为含氯仿和甲醇的水溶液，所述展开剂中氯仿、甲醇和水的体积比为60:40:1；
8、(5)利用三氯甲烷萃取真菌毒素aod粗提物，得到纯化的真菌毒素aod。
9、优选的，所述薄层色谱法的展开时间为30-90min
10、优选的，两段式避光培养采用的培养基为无菌米饭培养基；所述无菌米饭培养基的组分包括大米和水，所述大米和水的质量比为1:3。
11、优选的，所述两段式避光培养包括第一段避光培养和第二段避光培养；
12、所述第一段避光培养的条件为：25℃、180-250rpm避光培养2周；
13、所述第二段避光培养的条件为：10℃、180-250rpm避光培养2周。
14、优选的，所述步骤(2)中萃取次数为4次；所述甲醇水溶液中甲醇的体积百分含量为50％；每次萃取时，甲醇水溶液的用量为150-300ml；所述乙醚水溶液中乙醚和水的体积比为1:1。
15、优选的，所述步骤(3)中萃取次数为3次每次萃取时，乙酸乙酯的用量为20ml。
16、优选的，所述步骤(5)中萃取次数为3次；每次萃取时，三氯甲烷的用量为10ml。
17、本发明提供了一种真菌毒素aod及其衍生物的检测方法，包括以下步骤：
18、采用液相色谱-串联质谱检测真菌毒素aod；
19、其中，流动相a为含甲酸铵的甲醇-甲酸的水溶液，所述含甲酸铵的甲醇-甲酸的水溶液中甲醇、水和甲酸的体积比为58:41:1；流动相b为含甲酸铵的甲醇-甲酸溶液；所述含甲酸铵的甲醇-甲酸溶液中甲醇和甲酸的体积比为99:1；所述流动相a和流动相b中甲酸铵的浓度均为5mm。
20、优选的，所述液相色谱-串联质谱采用的色谱柱为zorbax eclipse plus c18，上样量为10μl。
21、优选的，所述液相色谱-串联质谱检测通过ms2扫描模式对真菌毒素aod进行定性分析，通过mrm模式对真菌毒素aod进行定量分析。
22、本发明公开了以下技术效果：
23、本发明提供了真菌毒素aod的制备方法填补了国内对于真菌毒素aod的制备空白，相较以往硅胶柱层析方法，改变了常规柱洗脱方式分离纯化，采用tlc法(薄层色谱法)从毒素粗提液中快速高效地分离得到了真菌毒素aod。由此可知，本发明提供了一种高效制备纯化aod毒素的简便方法。本发明还构建了lc-ms/ms(液相色谱-串联质谱)定量真菌病毒aod的方法，丰富了国内对于真菌毒素鉴定的方法。本发明采用了tlc法分离，能获得真菌毒素aod，并通过lc-ms/ms对aod及其衍生物进行定性及定量分析，从而提供一种切实有效的、快速制备纯化鉴定燕麦镰刀菌毒素aod的简便方法。
1.一种真菌毒素aod的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述薄层色谱法的展开时间为30-90min。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述两段式避光培养采用的培养基为无菌米饭培养基；所述无菌米饭培养基的组分包括大米和水，所述大米和水的质量比为1:3。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述两段式避光培养包括第一段避光培养和第二段避光培养；
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中萃取次数为4次；所述甲醇水溶液中甲醇的体积百分含量为50％；每次萃取时，甲醇水溶液的用量为150-300ml；所述乙醚水溶液中乙醚和水的体积比为1:1。
6.根据权利要求1所述的的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中萃取次数为3次；每次萃取时，乙酸乙酯的用量为20ml。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中萃取次数为3次；每次萃取时，三氯甲烷的用量为10ml。
8.一种真菌毒素aod及其衍生物的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述液相色谱-串联质谱采用的色谱柱为zorbax eclipse plus c18，上样量为10μl。
10.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述液相色谱-串联质谱检测通过ms2扫描模式对真菌毒素aod进行定性分析，通过mrm模式对真菌毒素aod进行定量分析。
