本发明属于生物医药领域，具体涉及一种sars-cov-2抗原诱发的细胞因子风暴小鼠模型的构建方法及其应用。
背景技术：
1、细胞因子风暴(cytokine storm)即细胞因子释放综合征(cyokine releasesyndrome,crs)，是机体对感染所发生的过度反应。在机体受到某些病毒感染或者免疫功能出现异常时，体内的细胞因子平衡被打破，促炎性细胞因子持续大量的产生，不断活化更多的免疫细胞聚集到炎症部位。过多的免疫细胞及多种促炎细胞因子会引起组织充血、水肿、发热、损伤，还可能引起其它继发性感染甚至导致“全身炎症反应综合征”(脓毒败血症)，使患者因多器官衰竭而死亡。
2、中重度covid-19患者致死的主要原因就是细胞因子风暴的发生与发展，开发能够减轻细胞因子风暴的药物刻不容缓。病毒诱导的细胞因子风暴模型(病毒诱导模型)是研究covid-19最直接、有效的选择，但病毒研究存在一定的危险性，尤其是sars-cov-2病毒传染性强，对于实验室等级与人员资格都要求极高，所以一定程度上限制了这种病毒诱导的细胞因子风暴模型的选择。
3、动物模型对于病毒的病理学、疫苗开发和药物筛查至关重要。非人类的灵长类动物模型是临床前实验常用的动物模型，但是费用昂贵、使用不便、需要的设施相对复杂，这限制了这种动物模型在sars-cov-2中的应用。小鼠模型是一种更理想的临床前实验模型，因为其价格便宜、更容易获得，同时饲养条件简单。已经有用不同的策略产生了数种人体细胞的人血管紧张素转换酶2(hace2)转基因小鼠，并用于模拟sars-cov感染。通常，在转基因小鼠中由sars-cov-2引起的肺部病理与肺hace2表达水平相关。但是这种模型成本较高，且需要使用sars-cov-2病毒诱导，难以普遍推广。
4、开展新冠病毒动物研究需要动物p3实验室，但是在我国各大科研院所和企业中拥有动物p3实验室的机构并不多，这导致直接研究新冠病毒比较困难，也难以建立新冠病毒导致的细胞因子释放综合征的动物模型。即使建立相应动物模型，由于缺少p3实验室或者成本过高，也难以广泛推广使用。由于缺乏简单、有效、低成本的新冠病毒诱发细胞因子大量释放的动物模型，导致针对新冠病毒诱发细胞因子释放的药物开发进程缓慢。此外，也有研究者在使用替代病毒或者lps等物质构建炎症模型，但是非新冠病毒诱导的模型，无法真实反映新冠病毒促使机体释放大量细胞因子的真实状况。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明的目的在于为本领域提供一种sars-cov-2抗原诱发的细胞因子风暴小鼠模型及其构建方法，以解决现有技术中存在的上述技术问题。
2、本发明首次构建了一种不需要动物p3实验室就可以开展的新型冠状病毒抗原诱发细胞因子大量释放的小鼠体内模型，该模型构建方法操作简单，对实验室硬件和级别要求比较低，对操作人员的要求也比较低，适合各大科研院所和企业开发抗新型冠状病毒诱发细胞因子风暴的有效药物，也适用于临床筛选针对新冠患者治疗的有效药物。
3、本发明的上述目的通过以下技术方案得以实现：
4、本发明的第一方面提供了一种sars-cov-2抗原诱发的细胞因子风暴小鼠模型的构建方法。
5、进一步，所述方法包括如下步骤：给小鼠施用冠状病毒抗原、tnf-α和ifn-γ构建得到所述细胞因子风暴小鼠模型。
6、进一步，所述施用的方式为腹腔注射。
7、进一步，所述小鼠包括c57bl/6小鼠、balb/c小鼠、icr小鼠、km小鼠、nih小鼠或laca小鼠；
8、可选地，所述小鼠为c57bl/6小鼠。
9、进一步，所述冠状病毒抗原为sars-cov-2刺突蛋白或sars-cov-2核蛋白；
10、可选地，所述冠状病毒抗原为sars-cov-2刺突蛋白。
11、进一步，所述sars-cov-2刺突蛋白的施用剂量为1.0-5.0μg/只；
12、所述tnf-α的施用剂量为0.5-2.5μg/只；
13、所述ifn-γ的施用剂量为0.5-2.5μg/只。
14、进一步，所述sars-cov-2刺突蛋白的施用剂量为2.76μg/只；
15、所述tnf-α的施用剂量为1.5μg/只；
16、所述ifn-γ的施用剂量为1.5μg/只。
17、进一步，给小鼠同时施用冠状病毒抗原、tnf-α和ifn-γ6h后构建得到所述细胞因子风暴小鼠模型。
18、在本发明中，所述冠状病毒是自然界中广泛存在的一大类病毒。冠状病毒在系统分类上属套式病毒目(nidovirales)冠状病毒科(coronaviridae)冠状病毒属(coronavirus)。冠状病毒属的病毒是具囊膜(envelope)、基因组为线性单股正链的rna病毒。冠状病毒直径约80-120nm，基因组5′端具有甲基化的帽状结构，3′端具有poly(a)尾，基因组全长约27-32kb，是已知rna病毒中基因组最大的病毒。
19、在一些实施方案中，所述冠状病毒包括但不限于：新型冠状病毒(sars-cov-2)、人类冠状病毒229e(hcov-229e)、人类冠状病毒oc43(hcov-oc43)、人类冠状病毒nl63(hcov-nl63)、人类冠状病毒hku1(hcov-hku1)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(sars-cov)、中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov)。
20、在本发明的具体实施方案中，所述冠状病毒为新型冠状病毒sars-cov-2或其相关变体。
21、在本发明中，所述细胞因子风暴又称细胞因子释放综合征，缩写为crs，是机体对感染所发生的过度反应。目前，细胞因子风暴的具体病理生理机制尚不明确，也尚无专门对应的治疗药物。
22、在一些实施方案中，所述细胞因子风暴可以为各类病毒感染、大分子抗体治疗、器官移植或car-t治疗引起的细胞因子风暴。
23、在优选的实施方案中，所述细胞因子风暴为病毒感染引起的细胞因子风暴。
24、在更优选的实施方案中，所述细胞因子风暴为冠状病毒感染引起的细胞因子风暴。
25、在本发明的具体实施方案中，所述细胞因子风暴为sars-cov-2感染引起的细胞因子风暴。
26、在本发明中，本发明首次采用sars-cov-2抗原联合tnf-α和ifn-γ注射入小鼠腹腔中构建细胞因子风暴小鼠模型，采用本发明如前所述的构建方法仅需6h就能够造模成功，并且采用本发明如前所述的构建方法构建得到的细胞因子风暴小鼠模型产生的细胞因子量更大，不仅能够刺激小鼠腹腔中产生细胞因子风暴相关的细胞因子，而且能够促使小鼠血液中产生细胞因子风暴相关的细胞因子，更能够模拟sars-cov-2诱发人体释放大量细胞因子的现象，为本领域提供了一种全新的、细胞因子风暴模拟效果更好的可有效用于抗冠状病毒感染药物筛选的细胞因子风暴小鼠模型。
27、本发明提供的全新的细胞因子风暴小鼠模型可用于抑制或降低sars-cov-2导致的细胞因子风暴的药物的筛选中，有利于抑制细胞因子风暴相关药物的开发。此外，本发明提供的全新的细胞因子风暴小鼠模型还可用于临床治疗sars-cov-2感染患者的用药筛选中，提高对所述感染患者的治疗效果的同时，降低不必要的用药，降低治疗成本。
28、虽然tnf-α常常用作小鼠炎症模型诱导剂，但是其使用剂量通常较大(10μg每只小鼠)，该剂量虽然可以有效诱导小鼠产生炎症，但是同时也会导致小鼠迅速死亡。本发明发现即使使用5μg tnf-α每只小鼠的剂量腹腔注射，小鼠也会在30h内全部死亡，而采用本发明提供的构建方法构建得到的模型小鼠直至48h依然存活。
29、在本发明中，所述tnf-α为肿瘤坏死因子α，也被称作cachectin或tnfsf1a，是tnf超家族的配体。它是一种多效细胞分子，在细胞凋亡和免疫系统发育中起着核心作用。tnf-α由巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞、cd4+t细胞、nk细胞分泌。tnf-α可以协同调节其它细胞因子的产生、细胞存活和死亡来协调组织的稳态。
30、tnf-α存在两种生物活性形式：跨膜形(tmtnf-α)和分泌形(stnf-α)。在许多病理状态下表达增多，包括败血症、恶性肿瘤、心脏衰竭和慢性炎性疾病。tnf-α也可以由肿瘤相关微环境中的恶性细胞和免疫细胞产生，其作为内源性肿瘤启动子，通过产生炎症生态环境来促进恶性疾病的进展。
31、在本发明中，所述ifn-γ为干扰素-γ，是细胞因子的一种，主要是t细胞和nk细胞等产生的一种促炎细胞因子。其拥有不同的免疫作用机制，在多个信号通路中产生免疫调节反应；ifn-γ具有广谱抗病毒、免疫调节功能。ifn-γ在肿瘤微环境中的作用十分复杂，其既能够发挥抗肿瘤作用，在某些条件下也有促进肿瘤发生的作用。
32、根据干扰素细胞来源不同、理化性质和生物学活性的差异，干扰素可分为ifn-α、ifn-b、ifn-γ；ifn-γ也叫亚型干扰素，主要由活化t细胞和nk细胞产生，人ifn-γ成熟分子以同源二聚体糖蛋白形式存在。
33、在一些实施方案中，小鼠注射用的sars-cov-2病毒抗原的浓度为200nm(27.6ng/μl)的刺突蛋白，注射计量为100μl每只小鼠，每只小鼠注射2.76μg刺突蛋白。
34、在一些实施方案中，每只小鼠tnf-α的注射剂量为0.5-2.5μg，优选为1.5μg每只小鼠。
35、在一些实施方案中，每只小鼠ifn-γ的注射剂量为0.5-2.5μg，优选为1.5μg每只小鼠。
36、在一些实施方案中，所述施用的方式包括但不限于腹腔注射、静脉注射、皮下注射、肌肉注射和/或脑室内注射。
37、在优选的实施方案中，所述施用的方式为腹腔注射或静脉注射。
38、在更优选的实施方案中，所述施用的方式为腹腔注射。
39、在一些实施方案中，所述小鼠可选自本领域常用的小鼠品系中的任意一种。
40、在优选的实施方案中，所述小鼠为免疫健全小鼠，包括但不限于：c57bl/6小鼠、balb/c小鼠、icr小鼠、km小鼠、nih小鼠或laca小鼠。采用免疫健全小鼠更能真实反映机体受病毒抗原刺激后，免疫应答的真实变化。
41、在更优选的实施方案中，所述小鼠为c57bl/6小鼠，其具有不需要任何基因改造、价格便宜、容易饲养、便于推广等优点。
42、在本发明的具体实施方案中，本发明所使用的c57bl/6小鼠体重保持一致，周龄为8周左右。周龄过大，炎症反应可能更强，但死亡风险增加，不利于长期观察。现有技术常用的小鼠多为基因工程改造的小鼠，不仅成本高，而且诱发细胞因子风暴时需要使用sars-cov-2病毒，对实验室级别和操作人员均有特殊要求，不便于推广应用，而采用本发明所述的c57bl/6能够克服现有技术中存在的上述问题。
43、在一些实施方案中，所述冠状病毒抗原包括但不限于：刺突蛋白(s)、核蛋白(n)、包膜蛋白(e)、膜蛋白(m)和/或血凝素-酯酶糖蛋白(he)。
44、在优选的实施方案中，所述冠状病毒抗原为刺突蛋白(s)或核蛋白(n)。
45、在更优选的实施方案中，所述冠状病毒抗原为刺突蛋白(s)。
46、在本发明的具体实施方案中，本发明所使用的是sars-cov-2刺突蛋白，而非sars-cov-2病毒，因此，本发明提供的如前所述的细胞因子风暴小鼠模型构建方法对实验室级别要求低，对操作人员要求也不高，便于推广。
47、此外，本发明所采用的tnf-α的浓度比较低，不会因为tnf-α剂量过大而造成小鼠体内脏器迅速大量损伤、小鼠迅速死亡的问题。
48、本发明的第二方面提供了一种sars-cov-2抗原诱发的细胞因子风暴小鼠模型。
49、进一步，所述细胞因子风暴小鼠模型为采用本发明第一方面所述的方法构建得到的细胞因子风暴小鼠模型。
50、在一些实施方案中，采用本发明第一方面所述的方法给所述小鼠同时施用所述冠状病毒抗原、tnf-α和ifn-γ6h后即可成功构建得到所述细胞因子风暴小鼠模型。
51、本发明的第三方面提供了如本发明第一方面所述的方法构建得到的细胞因子风暴小鼠模型在筛选抑制细胞因子风暴的药物中的应用。
52、在一些实施方案中，所述抑制细胞因子风暴的药物包括但不限于：任何可能发挥抑制细胞因子风暴作用的小分子化合物、多肽、蛋白质、抗体、疫苗、核酸分子、聚糖、中药提取物等。
53、本发明的第四方面提供了一种筛选抑制细胞因子风暴的药物的筛选方法。
54、进一步，所述方法包括如下步骤：采用如本发明第一方面所述的方法构建得到的细胞因子风暴小鼠模型筛选能够抑制细胞因子风暴的候选药物。
55、在一些实施方案中，所述候选药物包括但不限于：任何可能能够发挥抑制细胞因子风暴作用的小分子化合物、多肽、蛋白质、抗体、疫苗、核酸分子、聚糖、中药提取物等。
56、在一些实施方案中，所述方法包括如下步骤：给如本发明第一方面所述的方法构建得到的细胞因子风暴小鼠模型施用合适剂量的候选药物，通过检测施用候选药物后的所述细胞因子风暴小鼠模型的细胞因子风暴相关炎性因子的释放情况判断所述候选药物是否能够成为抑制细胞因子风暴的有效药物。
57、在一些实施方案中，若所述候选药物能够抑制所述细胞因子风暴小鼠模型的细胞因子风暴相关炎性因子的释放，则所述候选药物为能够抑制细胞因子风暴的有效药物。
58、在一些实施方案中，采用elisa或cba检测所述候选药物对所述细胞因子风暴小鼠模型的细胞因子风暴相关炎性因子的释放情况的影响。
59、在一些实施方案中，所述elisa即酶联免疫吸附实验(enzyme linkedimmunosorbent assay,elisa)，elisa法是检测细胞因子最经典的方法，也是目前应用最广泛、技术最成熟的一种免疫检测技术，常用的是双抗体夹心法。elisa法可以直接检测分泌到细胞外的处于游离状态的细胞因子，灵敏度高、操作简单、经济实惠，实验室配备一台酶标仪就可以完成整个实验。
60、在一些实施方案中，所述cba即细胞因子微球检测技术(cytometric bead array,cba)，cba是一种基于流式细胞检测系统的多重蛋白定量检测方法，它能够同时对单个样品中的多个指标进行检测。其作用原理是利用荧光强度不同的微球，上面带有可以辨认特定蛋白的抗体(capture antibody)，与样本(例如血清、血浆、培养上清液、细胞裂解液等)及pe检测抗体(detection antibody)作用后，以流式细胞仪进行分析，根据pe荧光强度的不同用软件进行分析和标准品做比对后，可进行样本内特定蛋白的定量。相较于elisa，更加节约样品，操作更便捷。
61、相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果：
62、本发明首次公开采用新型冠状病毒抗原联合tnf-α与ifn-γ能够成功诱导得到细胞因子风暴小鼠模型，该模型构建方法操作简单，不需要动物p3实验室，对操作人员、实验室硬件和级别要求比较低，适合各大科研院所和企业开发抗新型冠状病毒诱发细胞因子风暴的有效药物，也适用于临床筛选针对新冠患者治疗的有效药物，应用前景广阔。
1.一种sars-cov-2抗原诱发的细胞因子风暴小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：给小鼠施用冠状病毒抗原、tnf-α和ifn-γ构建得到所述细胞因子风暴小鼠模型。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述施用的方式为腹腔注射。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述小鼠包括c57bl/6小鼠、balb/c小鼠、icr小鼠、km小鼠、nih小鼠或laca小鼠；
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述冠状病毒抗原为sars-cov-2刺突蛋白或sars-cov-2核蛋白；
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述sars-cov-2刺突蛋白的施用剂量为1.0-5.0μg/只；
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述sars-cov-2刺突蛋白的施用剂量为2.76μg/只；
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，给小鼠同时施用冠状病毒抗原、tnf-α和ifn-γ6h后构建得到所述细胞因子风暴小鼠模型。
8.一种sars-cov-2抗原诱发的细胞因子风暴小鼠模型，其特征在于，所述细胞因子风暴小鼠模型为采用权利要求1-7中任一项所述的方法构建得到的细胞因子风暴小鼠模型。
9.如权利要求1-7中任一项所述的方法构建得到的细胞因子风暴小鼠模型在筛选抑制细胞因子风暴的药物中的应用。
10.一种筛选抑制细胞因子风暴的药物的筛选方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：采用如权利要求1-7中任一项所述的方法构建得到的细胞因子风暴小鼠模型筛选能够抑制细胞因子风暴的候选药物。
