本发明涉及生物制品，尤其是一种对17种蜱媒病原体的多重检测方法，特别使用了属于液相芯片的novaht多重荧光生物分析系统。
背景技术：
1、蜱虫是一种吸血性寄生虫，广泛分布于世界各地，是全球仅次于蚊子的第二大传染病媒介生物，携带包括病毒、立克次体、细菌等在内的多种病原体，可以感染、寄生鸟类、哺乳动物等生物并传播多种人畜共患传染病，对人类健康、畜牧养殖业存在巨大威胁。建立针对高危蜱媒病原的核酸检测技术对于防控蜱传疾病、临床诊断至关重要，而现有的蜱媒病原检测手段较为有限，具有检测对象单一、灵敏度低、操作难度大、结果判定过于依赖主观判断等等局限性。
2、本发明筛选了目前国内外流行广泛、危害严重的主流蜱传病原体作为检测目标。其中，蜱媒病毒包括发热伴血小板减少综合征病毒(severe feverwith thrombocytopeniasyndrome bunyavirus，sftsv)、蜱传脑炎病毒(tick-borne encephalitis virus，tbev，又称森林脑炎病毒)、汉坦病毒(hantaan virus，htnv)、汉城病毒(seoul virus)、新疆出血热病毒(又称克里米亚－刚果出血热病毒，crimean–congo hemorrhagic fever virus，cchfv)。螺旋体，是一种在生物学上介于细菌与原虫之间的原核单细胞生物，本发明检测目标主要包括蜱媒传播的回归热螺旋体(borrelia recurrentis)、伯氏疏螺旋体(borreliaburgdorferi)、钩端螺旋体(leptospira)。立克次氏体(rickettsia)是介于细菌与病毒之间，而接近于细菌的一类原核生物，种类多，我国存在的立克次体病主要包括恙虫病、q热、流行性斑疹伤寒等20余种，本发明根据流调数据重点针对无形体(anaplasmaphagocytophilum)、立克次氏体(rickettsia)、普氏立克次氏体(rickettsiaprowazekii)、莫氏立克次氏体(rickettsiamoseri)、恙虫病东方体(orientiatsutsugamushi)、贝纳柯克斯体(coxiella burnetii)、新埃里克体(candidatusehrlichia erytraense)。检测目标病原体还包括属于革兰氏阴性细菌的巴尔通体(bartonella)和属于原生动物门的寄生虫——巴贝斯虫(babesiamicroti)。
3、液相芯片(liquid array或suspension array)，是一种在液体环境中通过微球或其他悬浮载体进行检测的技术，结合了传统芯片技术和现代生物化学分析方法的优势，可以进行蛋白、核酸等生物大分子的高通量检测，为新型的高通量核酸检测平台，主要包括流式荧光检测技术(如luminex平台)和ccd成像检测技术(如biocode 2500系统)，比如luminex平台通过将不同荧光微球标记不同探针，探针进一步与微球以及核酸序列进行特异性结合，在一个反应孔内可以进行多种靶标的检测反应，结合产物在特定波长激光激发下会产生光信号，从而实现对核酸的多重检测，虽然具有高通量、灵活、准确、重复性好等优点，但是，传统的液相芯片检测平台都存在检测方法耗时长、步骤繁琐、缺乏统一的标准化规范和操作指南而导致检测结果互认性和可比性较低，并且需要依赖高精度的仪器和专业的检测系统而导致检测成本较高等问题，此外传统的液相芯片检测平台的开发周期长，开发难度大，开发成本高昂。因此，亟需建立一种快速、高通量、可标准化互认、低成本地精确检测多重病原体的检测方法，从而满足对大规模疑似蜱媒病原体感染的临床样品进行多重检测需求。
技术实现思路
1、本发明的目的在于至少部分地克服现有技术的缺陷，提供一种对17种蜱媒病原体的多重检测方法。
2、为达到上述目的，本发明要求保护一种引物和探针组合物，用于novaht多重荧光生物分析系统对17种蜱媒病原体进行多重检测。
3、本发明的目的还在于提供一种对17种病原体进行多重检测的试剂盒和一种对17种病原体的多重检测方法。
4、第一方面，本发明提供了一种引物和探针组合物，用于novaht多重荧光生物分析系统对17种蜱媒病原体进行多重检测，病原体包括回归热螺旋体、巴贝斯虫、立克次氏体、恙虫病东方体、普氏立克次氏体、莫氏立克次氏体、贝纳柯林斯体、钩端螺旋体、巴尔通体、新埃里克体、无形体、伯氏疏螺旋体、汉坦病毒、汉城病毒、蜱传脑炎病毒、发热伴血小板减少综合征病毒、新疆出血热病毒；该引物和探针组合物包括外引物、内引物和探针，在内引物的下游引物的5'端标记有生物素；其中，针对病原体的外引物核苷酸序列依次为序列表中seq id no:1-51所示；针对病原体的内引物核苷酸序列依次为序列表中seq id no:54-103所示；针对病原体的探针核苷酸序列依次为序列表中seq id no:107-128所示。
5、根据本发明的一个优选实施例，引物和探针组合物中还包括针对内参的外引物、内引物和探针，内参的靶标基因为globin，针对内参的外引物核苷酸序列依次为序列表中seq id no:52-53所示；针对内参的内引物核苷酸序列依次为序列表中seq id no:104-106所示；针对内参的探针核苷酸序列依次为序列表中seq id no:129所示。
6、根据本发明的一个优选实施例，荧光微球上偶联的tag序列能够和引物和探针组合物中的探针进行特异性互补结合。
7、第二方面，本发明提供一种对17种病原体进行多重检测的试剂盒，包括上述引物和探针组合物。
8、根据本发明的一个优选实施例，对17种病原体进行多重检测的试剂盒中还包括链霉素亲和素和藻红蛋白的偶联物sa-pe，并采用流式点阵仪进行上机检测。
9、根据本发明的一个优选实施例，对17种病原体进行多重检测的试剂盒中还包括阴性质控品。
10、优选地，阴性质控品为无菌水；
11、进一步优选地，无菌水为去核酸酶水nuclease-free water；
12、第三方面，本发明提供了一种对17种病原体的多重检测方法，包括上述引物和探针组合物，检测步骤包括二轮pcr扩增、与荧光微球的杂交反应，以及用流式点阵仪进行上机检测。
13、根据本发明的一个优选实施例，二轮pcr扩增为以外引物为基础对待测样本进行第一轮扩增，和以内引物和第一轮扩增产物为基础进行第二轮扩增，第二轮扩增获得的第二轮扩增产物上带有内引物上标记的生物素；杂交反应包括，先将探针与对应的荧光微球制备成液相芯片，再将第二轮扩增产物与液相芯片上探针进行杂交形成杂交产物。
14、根据本发明的一个优选实施例，杂交反应还包括加入链霉素亲和素和藻红蛋白的偶联物sa-pe，使第二轮扩增产物上标记的生物素与链霉素亲和素和藻红蛋白的偶联物之间进行偶联反应。
15、第四方面，本发明提供了一种引物和探针组合物，一种对17种病原体进行多重检测的试剂盒，一种对17种病原体的多重检测方法，在制备蜱媒病原体多重检测试剂盒中的应用。
16、本发明的有益效果：
17、本发明采用novaht多重荧光生物分析系统，提供了一种对17种蜱媒病原体的多重核酸检测方法，这17种蜱媒病原体为回归热螺旋体，巴贝斯虫，克次氏体、恙虫病东方体、普氏立克次氏体、莫氏立克次氏体，贝纳柯林斯体，钩端螺旋体，巴尔通体，新埃里克体，无形体，伯氏疏螺旋体，汉坦病毒，汉城病毒，发热伴血小板减少综合征病毒，蜱传脑炎病毒和新疆出血热病毒。目前，针对蜱媒病原体的检测方法大多数为单一病原的单独检测，无法同时检测多种病原，本发明这17种蜱媒病原体涵盖了临床发热伴皮疹症侯群的相关重要病原体，对一份待测样品同时进行17种病原体的19个靶标基因的定量核酸检测，不仅节省了样品的采集量(比如采血管数量)，还能够进一步节省了检测时间和多项目的检测成本，提高了检测的效率，具有了良好的应用前景。
18、本发明对17种蜱媒病原体，最后针对19个靶标基因和1个内参基因共筛选获得了53条外引物、53条内引物和23条探针的引物和探针组合物，共同用于对这17种蜱媒病原体进行多重联合检测，共涉及检测20种目的基因及与之对应的129条引物和探针，本发明采用novaht多重荧光生物分析系统，一方面通过优化具体反应条件、采用生物素-亲和素和荧光微球的双重标记，另一方面还通过在引物和探针序列设计过程中，不断优化和调整序列，在很多引物和探针序列中引入了1-3个简并碱基。上述优化不仅克服了引物间的相互干扰或二聚体等交叉非特异性反应影响，特别是简并碱基的存在能够克服病原体不同株系间存在无法预测的进化变异等不确定情况，特别是能够覆盖检测5种病毒6个靶标基因的不同病毒株。而且还能够在17种病原体20个目的基因的检测灵敏度与准确度之间的平衡，本发明完成了对20个检测靶标在保证高灵敏度的同时保持高准确度无疑是一个巨大的成功挑战。
19、传统对病原体的pcr扩增往往使用一对引物且只经过一轮扩增，本发明在液相芯片的基础上结合了巢氏pcr的原理，对一个病原使用两套引物(外引物，内引物)先后进行两轮pcr扩增，不仅避免了在样品核酸提取过程中由于样品的系统性损失，而导致的假阴性结果，而且增加对病原检测的检出率。此外，无论外引物还是内引物，在引物设计优化过程中，除了使用一对引物，某些病原体的引物设计还包括调整引物的条数，比如用于完成对同一目的基因一轮pcr扩增的一套引物中，不仅存在至少1对至3对对称数量的引物组合，还包括3条或5条不对称数量的引物组合。本发明通过对称或不对称数量的引物组合的优化、结合采用两套引物先后两轮的pcr扩增，在提高多重检测覆盖范围的同时，还提高了多重检测pcr扩增的特异性。
20、此外，本发明采用novaht多重荧光生物分析系统属于液相芯片，不同于传统的固相芯片技术，无需在芯片上进行点样，而是将探针结合于微球载体上，悬浮于液态环境中对样品进行检测。该方法具有操作简便、耗时短、高通量以及准确性高的优点，适合大量样品的高通量快速检测。而且本发明的novaht多重荧光生物分析系统基于流式点阵仪进行检测，相对于传统的luminex液相芯片多重检测技术依赖于购买、维护和使用成本都较高的流式细胞仪而言，在保证检测性能的同时大大降低了成本，而且novaht流式点阵仪作为国产设备，该技术商业化应用可以摆脱对进口设备和鞘液等试剂的依赖。本发明采用novaht多重荧光生物分析系统，检测结果包括荧光强度的平均值等数据化结果，具有统计学意义，且可以实现自动分析，有利于实现检测结果报告的自动化。
21、本发明提供了一种优选的对17种蜱媒病原体的多重检测方法，包括对待测核酸样品进行两轮pcr扩增，pcr产物上的生物素与sa-pe结合、特异性探针与荧光微球结合形成了最终的杂交产物，以红色激光激发荧光微球上的分类荧光并识别荧光微球的类型，以绿色激光激发藻红蛋白(pe)进一步提高了荧光信号的强度，最终以荧光微球的中位荧光强度值(mfi)作为检测结果的判定标准，阴阳性数值之间差异明显，而且检测结果的输出可以实现数字化、自动化。本发明提供的对17种蜱媒病原体的多重检测平台包括对17种蜱媒病原体的多重检测试剂盒和相应标准物质等，不仅实现对17种病原体的多重检测，灵敏度至少高达10copies/μl，而且不同病原体之间不存在交叉影响，检测特异性良好；经过对临床样品的验证及第三方检测试剂或检测方法的复核，可见本发明提供的对17种蜱媒病原体的多重检测方法可靠性较高。本发明对17种蜱媒病原体的多重检测方法，实现了对17种病原体19个靶标基因的多重检测，而且相对于传统的单一病原体核酸检测，克服了随着病原数量的增加、灵敏度下降的局限性。而且本发明对17种蜱媒病原体的多重检测平台还设置了内参和标准物质，检测操作简便，在二轮pcr扩增后，不需要对pcr产物进行处理，可直接进行杂交反应，节省了样品使用量、检测反应步骤、检测时间。此外，本发明检测不依赖于传统的流式细胞仪，检测成本相对较低。
1.一种引物和探针组合物，用于novaht多重荧光生物分析系统对17种蜱媒病原体进行多重检测，所述病原体包括回归热螺旋体、巴贝斯虫、立克次氏体、恙虫病东方体、普氏立克次氏体、莫氏立克次氏体、贝纳柯林斯体、钩端螺旋体、巴尔通体、新埃里克体、无形体、伯氏疏螺旋体、汉坦病毒、汉城病毒、蜱传脑炎病毒、发热伴血小板减少综合征病毒、新疆出血热病毒；
2.根据权利要求1所述的引物和探针组合物，其特征在于：还包括针对内参的外引物、内引物和探针，所述内参的靶标基因为globin，针对所述内参的外引物核苷酸序列依次为序列表中seq id no:52-53所示；针对所述内参的内引物核苷酸序列依次为序列表中seqid no:104-106所示；针对所述内参的探针核苷酸序列依次为序列表中seq id no:129所示。
3.根据权利要求1所述的引物和探针组合物，其特征在于：荧光微球上偶联的tag序列能够和所述探针进行特异性互补结合。
4.一种对17种病原体进行多重检测的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1-3中任一项所述的引物和探针组合物。
5.根据权利要求4所述的对17种病原体进行多重检测的试剂盒，其特征在于：还包括链霉素亲和素和藻红蛋白的偶联物sa-pe，并采用流式点阵仪进行上机检测。
6.根据权利要求4所述的对17种病原体进行多重检测的试剂盒，其特征在于：还包括阴性质控品。
7.一种对17种病原体的多重检测方法，其特征在于：包括权利要求1-3中任一项所述的引物和探针组合物，检测步骤包括二轮pcr扩增、与荧光微球的杂交反应，以及用流式点阵仪进行上机检测。
8.根据权利要求7所述的对17种病原体的多重检测方法，其特征在于：所述二轮pcr扩增为以所述外引物为基础对待测样本进行第一轮扩增，和以所述内引物和第一轮扩增产物为基础进行第二轮扩增，第二轮扩增获得的第二轮扩增产物上带有所述内引物上标记的生物素；所述杂交反应包括，先将所述探针与对应的荧光微球制备成液相芯片，再将第二轮扩增产物与所述液相芯片上探针进行杂交形成杂交产物。
9.根据权利要8所述的对17种病原体的多重检测方法，其特征在于：所述杂交反应还包括加入链霉素亲和素和藻红蛋白的偶联物sa-pe，使第二轮扩增产物上标记的生物素与链霉素亲和素和藻红蛋白的偶联物之间进行偶联反应。
10.权利要求1-3中任一项所述的引物和探针组合物，权利要求4-6中任一项所述的对17种病原体进行多重检测的试剂盒，权利要求7-9中任一项所述的对17种病原体的多重检测方法，在制备蜱媒病原体多重检测试剂盒中的应用。
