本发明涉及基因工程，具体而言，涉及一种腈水解酶突变体及其在生产d-扁桃酸中的应用。
背景技术：
1、扁桃酸又称苦杏仁酸，其有一个手性碳原子，有(r)型和(s)型两个对映体。r-扁桃酸(即d-扁桃酸)是一种有着广泛用途的化学中间体，在有机合成和药物生产中有着广泛的用途，是药物合成、染料领域常用的原料或中间体，如用于半合成青霉素和头孢菌素等抗生素、血管扩张剂、杀菌剂、镇痉剂、减肥药物、抗肿瘤药物等的合成；也用作杀菌剂或防腐剂。近年来，r-扁桃酸的需求逐年增长，市场潜力巨大，加快r-扁桃酸的制备开发具有重要的意义。
2、d-扁桃酸的制备方法不对称合成法、光学异构体拆分法、生物合成法，其中生物转化法为最理想的方法。生物转化法的合成路线大多是以扁桃腈为底物，通过腈水解酶将其转化为d-扁桃酸。比如申请号为202111620813.7的专利，其采用了一种腈水解酶催化制备d-扁桃酸，但在该方法中在酶催化过程中使用了溶剂甲基异丁酮，提高了生成成本；申请号为200910154484.4的专利，其使用腈水解酶催化d-扁桃腈制备d-扁桃酸，底物浓度耐受度低，水解过程采用分批加料的方式，且未提到产物提取等后处理方式，不利于工业生产上的应用；申请号为200910155228.7的专利，其产物提取采用树脂洗脱的方式，方法繁琐，同样不适用于放大生产。
3、鉴于此，特提出本发明。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种腈水解酶突变体及其在生产d-扁桃酸中的应用，通过对腈水解酶进行定点突变，获得的腈水解酶突变体对底物的活性和耐受能力得到提高，且反应过程中无需分批加料，也不需要其他有机溶剂，利用本发明的腈水解酶突变体生产d-扁桃酸，其能够提高生产效率，降低生产成本。
2、本发明是这样实现的：
3、本发明合成d-扁桃酸的路线如图1所示，其以d-扁桃腈为底物，通过腈水解酶转化制备d-扁桃酸。
4、本发明在野生型腈水解酶的基础上通过基因位点饱和诱变法进行突变，获得了一种腈水解酶突变体。具体地，野生型腈水解酶的氨基酸序列如seq id no.1所示，核苷酸序列如seq id no.3所示。腈水解酶突变体是seq id no.1所示的氨基酸序列基础进行的突变，突变位点包括第132位、第189位、第196位、和第284位。
5、其中，第132位的突变方式为：赖氨酸突变为丙氨酸，即k132a。
6、第189位的突变方式为：脯氨酸突变为苏氨酸，即p189t。
7、第196位的突变方式为：甘氨酸突变为丝氨酸，即g196s。
8、第284位的突变方式为：异亮氨酸突变为丙氨酸，即i284a。
9、上述第132位、第189位、第196位、和第284位的突变能够提高腈水解酶活性以及底物耐受性，进而提高d-扁桃酸的合成效率。
10、进一步地，腈水解酶突变体的突变方式为k132a、p189t、g196s和i284a的组合。上述腈水解酶突变体的氨基酸序列如seq id no.2所示，核苷酸序列如seq id no.4所示。
11、通过上述腈水解酶突变体可以获得相关的生物材料，其包括：含有上述核酸分子的表达盒；含有上述核酸分子的重组载体、或含有上述表达盒的重组载体；含有上述核酸分子的重组菌、或含有上述表达盒的重组菌、或含有上述重组载体的重组菌。
12、在一些实施例中，表达上述腈水解酶突变体的重组菌的构建方法包括：将腈水解酶突变体的核苷酸序列连接到表达载体上，再将获得的重组载体转化出发菌株中，培养出发菌株，诱导表达腈水解酶突变体。
13、表达载体和宿主细胞可以是本领域常规选择，在一些实施例中，表达载体为pet28ma，出发菌株为大肠杆菌。通过采用上述方法进行蛋白诱导表达、细胞破碎获得粗酶液，获得的腈水解酶突变体催化活性优于原始酶。
14、基于此，本发明还提供了一种发酵剂，其活性成分包括上述腈水解酶突变体和/或生物材料。
15、同时，本发明还提供的一种生产d-扁桃酸的方法包括：将腈水解酶突变体加入转化体系中进行反应，再经过分离、过滤、浓缩、结晶和干燥后获得d-扁桃酸；其中转化体系中包括d,l-扁桃腈、氢氧化钠和磷酸钠缓冲液。
16、在一些实施例中，在生产d-扁桃酸过程中，腈水解酶突变体的添加量为1.2-1.6g/10ml d,l-扁桃腈；在转化体系中d,l-扁桃腈的浓度为400mm-1000mm。
17、为了获得更高的收率和纯度，发明人进一步优化了反应条件，发现当底物浓度为400mm-1000mm，腈水解酶突变体与底物的质量体积比为1.2-1.6：10g/ml时收率最高可达90％以上，纯度可达99％以上。
18、在一些实施例中，上述腈水解酶突变体在反应体系中的反应条件为：ph为7.5-8.0，温度为25℃-35℃，摇床转速200rpm-300rpm。
19、在一些实施例中，上述腈水解酶突变体通过上述重组菌表达获得，包括：将构建的重组菌进行诱导、培养，结束后进行破碎、离心并收集上清，即得腈水解酶突变体酶液。
20、具体地，将构建的重组菌接种至含卡那霉素的lb培养基中，在30℃-40℃、200rpm下培养10h后，按2％-3％的接种量接入装有tb培养基的摇瓶中；在30℃-40℃、200rpm摇床培养，当培养液的od600nm达到0.6 0.8时加入浓度为0.2mm的iptg，20℃-25℃，180rpm下诱导12h；在4℃-5℃，8000rpm下离心10min或6000rpm离心20min收集上清菌体，用100mm ph为7.0的磷酸钠缓冲液洗涤两次；将获得的菌体用100mm ph为7.0的磷酸钠缓冲液悬浮，冰浴中超声破碎，离心收集上清，得到腈水解酶突变体酶液。
21、在一些实施例中，生产d-扁桃酸的方法还可以是：将表达上述腈水解酶突变体的重组菌进行破碎，然后将其上清液加入转化体系中反应，获得d-扁桃酸。
22、通过全细胞转化的方法也可以获得较高的收率和纯度，其中底物与重组菌的质量比为：5：0.021；反应条件为：ph为7.5-8.0，温度为25℃-35℃，摇床转速200-300rpm。
23、在一些实施例中，反应结束后对反应体系进行依次分离、过滤、浓缩、结晶和干燥，具体地，在反应结束后，升高温度至80℃-90℃灭活，然后降温到40℃-50℃，加入100ml0.1g/ml硅藻土搅洗后过滤；将过滤后的溶液进行70℃-80℃减压浓缩，浓缩到反应体系体积的30％以下，然后调节浓缩后的溶液ph至ph＝1～1.5，搅拌降温至5℃-10℃，结晶、干燥。
24、本发明具有以下有益效果：
25、本发明提供了一种腈水解酶突变体以及其在催化d-扁桃酸中的应用，该突变体具有较高的催化活性及底物耐受性，能够转化d,l-扁桃腈制备d-扁桃酸，在反应时底物的最高反应浓度可达1m，水解过程无需分批加料，且不需要其他有机溶剂，后续处理步骤简单。同时本发明还优化了反应条件，最终收率可达90％以上，纯度99％以上，通过本发明的生产方法可以提高d-扁桃酸的生成效率，降低生产成本，因此本发明的腈水解酶突变体以及生产d-扁桃酸的方法具有良好的工业化应用前景。
1.一种腈水解酶突变体，其特征在于，所述腈水解酶突变体是在seq id no.1所示的氨基酸序列的基础上发生突变获得的，所述腈水解酶突变体的突变位点包括：第132位、第189位、第196位、和第284位。
2.根据权利要求1所述的腈水解酶突变体，其特征在于，所述腈水解酶突变体的突变方式为如下(1)-(4)的组合：
3.根据权利要求2所述的腈水解酶突变体，其特征在于，所述腈水解酶突变体的核苷酸序列如seq id no.4所示。
4.与权利要求1-3任一项所述的腈水解酶突变体相关的生物材料，其特征在于，为以下(1)-(3)中的任意一种：
5.如权利要求1-3任一项所述的腈水解酶突变体或权利要求4所述的生物材料在生产d-扁桃酸及其衍生物中的应用。
6.一种发酵剂，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的腈水解酶突变体或权利要求4所述的生物材料。
7.一种生产d-扁桃酸的方法，其特征在于，包括：将所述腈水解酶突变体加入转化体系中进行反应，再经过分离、纯化后获得d-扁桃酸；所述转化体系中包括d,l-扁桃腈、氢氧化钠和磷酸钠缓冲液。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述腈水解酶突变体的添加量为1.2-1.6g/10ml d,l-扁桃腈；所述转化体系中d,l-扁桃腈的浓度为400mm-1000mm；
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，分离包括：在反应结束后，升高温度至80℃-90℃灭活，然后降温到40℃-50℃，加入100ml 0.1g/ml硅藻土搅洗后过滤；
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述腈水解酶突变体的制备方法包括：将所述腈水解酶突变体的核苷酸序列连接到表达载体上，然后将获得的重组载体导入出发菌株中，获得表达所述腈水解酶突变体的重组菌，再将所述重组菌接种至培养基中进行培养、诱导，并破碎分离即可获得所述腈水解酶突变体。
