一种测定dl-对氯苯丝氨酸乙酯含量的hplc方法
技术领域
1.本发明涉及一种测定dl-对氯苯丝氨酸乙酯含量的hplc方法，特别是涉及一种利用高效液相色谱法(hplc)进行的dl-对氯苯丝氨酸乙酯中测定dl-对氯苯丝氨酸乙酯含量的分析方法。
背景技术：2.dl-对氯苯丝氨酸乙酯是一种有机中间合成体，可以用于合成新型氟苯尼考类抗生素，其中氟苯尼考是专用于兽药的广谱抗生素，具有抗革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的广谱活性，广泛用于动物细菌感染的预防和治疗。据专利cn201611146617.x报道，近年来，许多细菌开始显示出对氟苯尼考的耐药性，促使了人们对新抗生素的需求，新型氟苯尼考类抗生素具有保留或超过氟苯尼考的活性，具有广阔的应用前景，而用于合成新型氟苯尼考类抗生素的dl-对氯苯丝氨酸乙酯，其市场前景可期。
3.氟苯尼考对应的中间体之一是dl-对甲砜基苯丝氨酸乙酯，韩玉英等在《dl-苏式-对甲砜基苯丝氨酸乙酯的合成及拆分》一文中报道了dl-对甲砜基苯丝氨酸乙酯纯度分析的高效液相色谱(峰面积归一法)条件，采用hyper ods2 c18色谱柱，流动相v(乙腈)：v(水)＝7:3，检测器波长，uv254nm。(精细化工，2011，28(6)：599-602.)该分析方法仅能对dl-对甲砜基苯丝氨酸乙酯进行分析，无法对dl-对氯苯丝氨酸乙酯进行分析。
4.公开号为cn 101832981 a的中国专利申请公开了一种测定d-对甲砜基苯丝氨酸乙酯含量的hplc方法，该方法采用硅胶表面涂覆纤维素-三(4-甲基苯甲酸酯)固定相的手性柱，以正己烷、异丙醇和三乙胺的混合溶液作为流动相，进行hplc分析，可以测定对d-对甲砜基苯丝氨酸乙酯中d酯和l酯的含量。此方法与本专利申请的含量分析方法有本质区别。
5.此外，申请人在实际工作中发现dl-对氯苯丝氨酸乙酯的合成过程中，主要可能存在的两种杂质对氯苯丝氨酸和对氯苯甲醛，现有的测定分析方法没有特别针对这两种杂质进行很好的检测，导致这些检测方法难以符合实际需求。
6.目前尚未有对dl-对氯苯丝氨酸乙酯含量的测定分析方法进行详细的阐述。综上所述，为了配合dl-对氯苯丝氨酸乙酯应用的发展，本发明进行了一项测定dl-对氯苯丝氨酸乙酯含量的分析方法研究。
技术实现要素：7.本发明提供了一种dl-对氯苯丝氨酸乙酯含量的hplc方法，该分析方法操作简单，结果准确，重现性好，灵敏度高，并且便于对对氯苯丝氨酸和对氯苯甲醛的检测。
8.一种测定dl-对氯苯丝氨酸乙酯含量的hplc方法，包括以下步骤：
9.(1)将dl-对氯苯丝氨酸乙酯待测样品进行稀释，得到供试液；
10.(2)采用高效液相色谱对步骤(1)的供试液进行分析，得到液相色谱数据；
11.所述的高效液相色谱所用的流动相为流动相a与流动相b的混合溶液；
12.所述的流动相a为缓冲盐与离子对试剂溶液；
13.所述的流动相b为有机相；
14.所述的缓冲盐与离子对试剂溶液配制方法如下：
15.将无机盐、离子对试剂与超纯水混合，然后用酸调ph至2.0～6.0得到；
16.(3)根据步骤(2)得到的液相色谱数据计算待测样品中dl-对氯苯丝氨酸乙酯的含量。
17.步骤(1)中，可以用0.8～1.2mol mol/l盐酸水溶液、0.1％磷酸水溶液、超纯水、起始洗脱比例溶液配制对照品溶液(如需要用到)及样品溶液，优选为优选0.8～1.2mol mol/l盐酸水溶液或超纯水。
18.作为优选，步骤(2)中，分析所用的色谱柱为化学键合固定相色谱柱：ultimate xb-phenyl(ⅱ)，优选c18、c8、c3、aq或苯基柱，更优选c18：柱长30～250mm(更优选250mm)；柱内径优选为1.0～10mm(更优选4.6mm)；色谱柱填料粒度范围在1.8～10μm(更优选5μm)。
19.所述检测器为可变波长检测器，检测波长为190～360nm，优选220～230nm，更优选225nm。
20.流动相流速为1.0～2.0ml/min，更优选为1.0ml/min。
21.作为优选，步骤(2)中，所述的缓冲盐与离子对试剂溶液中无机盐选自钠、钾、铵的醋酸盐、磷酸盐或硫酸盐，优选为磷酸二氢钾，缓冲盐在水中的浓度为0-100mm(更优选为10mm)，离子对试剂选自四丁基氢氧化铵、庚烷磺酸钠、四丁基溴化铵或十二烷基磺酸钠，优选为四丁基氢氧化铵，在水中的浓度为0.5-1.5mm(更优选为1.0mm)。
22.所述的有机改性剂选自乙腈、甲醇、四氢呋喃、乙醇、异丙醇、乙二醇、丙酮中的一种。
23.作为优选，所述的无机盐选为磷酸二氢钾，离子对试剂选为40％四丁基氢氧化铵，所述的有机相选自乙腈或甲醇。
24.作为优选，用来调节缓冲盐与离子对试剂溶液的ph值的酸选自磷酸、硫酸、醋酸、甲酸、三氟乙酸、高氯酸或盐酸，优选磷酸，ph范围为0.8～12，更优选为0.8～5.0。
25.作为优选，所述的缓冲盐与离子对试剂溶液用酸调ph至2.0～3.0。
26.作为优选，分析时采用梯度洗脱方法。
27.在实际操作过程中，为了减轻溶液混合时对分析过程的影响，一般不是直接将缓冲盐与离子对试剂溶液与有机相进行混合，而是在线进行混合分析。作为优选，流动相a为缓冲盐与离子对试剂溶液；流动相b为乙腈。
28.作为进一步的优选，梯度洗脱的流程如下：
29.(1)0～7min，流动相a与流动相b的体积比为90～85：10～15；
30.(2)7～12min，流动相a与流动相b的体积比为80～60：40～60；
31.(3)12～17min，流动相a与流动相b的体积比为50～40：60～50；
32.(4)17.1～27min，流动相a与流动相b的体积比为85～90：10～15
33.作为优选，所述的dl-对氯苯丝氨酸乙酯含量通过面积归一法计算得到。
34.同现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
35.(1)本发明对于dl-对氯苯丝氨酸乙酯样品，均无需特别处理，只需要准确称量后用稀释液溶解稀释即可。
36.(2)采用本发明的方法利用hplc测定dl-对氯苯丝氨酸乙酯中dl-对氯苯丝氨酸乙酯的含量，操作简单、结果准确、重现性好、灵敏度高，为dl-对氯苯丝氨酸乙酯质量标准的建立奠定基础。
37.(3)本发明的检测方法能够检测出dl-对氯苯丝氨酸乙酯的对氯苯丝氨酸和对氯苯甲醛两种杂质，因而特别适合dl-对氯苯丝氨酸乙酯合成工艺和产品质量的控制。
附图说明
38.图1实施例2中dl-对氯苯丝氨酸乙酯在流动相a的ph为2.0时的系统适应性色谱图，主峰出峰时间为12.241min。
39.图2实施例2中dl-对氯苯丝氨酸乙酯的样品溶液在流动相a的ph为2.2时色谱图，主峰出峰时间为12.100min。
40.图3为实施例3中dl-对氯苯丝氨酸乙酯样品溶液在流动相流速为1.1ml/min时的色谱图，主峰出峰时间为12.043min。
41.图4为实施例4中dl-对氯苯丝氨酸乙酯样品溶液在柱温为40℃时的色谱图，主峰出峰时间为12.310min。
42.图5为dl-对氯苯丝氨酸乙酯样品在波长为223nm时的色谱图，主峰出峰时间为12.002min。
43.图6为现有dl-苏式-对甲砜基苯丝氨酸乙酯纯度分析方法检测出dl-对氯苯丝氨酸乙酯样品溶液色谱图，主峰出峰时间为23.215min。
44.图7为ph＝2.0hclo4为流动相a条件下的dl-对氯苯丝氨酸乙酯样品溶液色谱图，主峰出峰时间为8.392min。
45.图8为dl-对氯苯丝氨酸乙酯样品氧化降解时的色谱图，主峰出峰时间为12.104min。
46.图9为dl-对氯苯丝氨酸乙酯样品酸降解时的色谱图，主峰出峰时间为12.144min。
47.图10为dl-对氯苯丝氨酸乙酯样品碱降解时的色谱图，主峰出峰时间为12.134min。
48.以下结合实施例对本发明做进一步说明，但这些实施例不得用于解释本发明保护范围的限制。
49.各实施例所用仪器均为agilent高效液相色谱仪；dl-对氯苯丝氨酸乙酯对照品为自制，含量大于99.5％。
50.在进行梯度洗脱时，流动相之间的比例，如无特殊说明，都为体积比。
具体实施方式
51.实施例1
52.色谱条件：
53.可变波长紫外检测器，检测波长：225nm；流速：1ml/min；柱温：35℃；进样体积：10μl；色谱柱：ultimate xb-c18。
54.流动相和洗脱方式：
55.流动相a为缓冲盐与离子对试剂溶液；流动相b为乙腈。洗脱方式为梯度洗脱。梯度
洗脱程序见下表：
56.时间(min)07121717.127流动相a908040409090流动相b102060601010
57.酸(对氯苯丝氨酸)储备液：称取50mg对氯苯丝氨酸对照品于100ml容量瓶中，加入1mol/l hcl溶解后，用纯水定容，摇匀。
58.醛(对氯苯甲醛)储备液：称取醛(对氯苯甲醛)对照品50mg于100ml容量瓶中，加乙腈5ml溶解后，用乙腈：水＝1:1稀释至刻度，称重、摇匀。
59.系统适应性溶液：称取dl-对氯苯丝氨酸乙酯对照品30mg于50ml容量瓶中，加入1mol/l hcl溶解后，分别加入1ml酸储备液和醛储备液于同一容量瓶中，加水定容，摇匀。(对氯苯丝氨酸浓度为0.01mg/ml)。
60.供试液(样品溶液)：称取dl-对氯苯丝氨酸乙酯湿品60mg于100ml容量瓶中，加入1mol/l hcl溶解后，用纯水定容，摇匀。(浓度为0.6mg/ml)。
61.实施例2
62.在选定色谱条件下：可变波长紫外检测器，检测波长：225nm；流速：1ml/min；柱温：35℃；进样体积：10μl；色谱柱：ultimate xb-c18。
63.缓冲盐加离子对试剂溶液：10mm磷酸二氢钾，1.0mm 40％四丁基氢氧化铵，用磷酸调ph值至2.0
±
0.2。
64.以梯度比例洗脱，分别进系统适应性溶液1针，要求酸、醛、酯拖尾因子≤2.0，对氯苯丝氨酸乙酯与相邻峰分离度≥1.5；样品溶液2针，样品溶液检测结果的绝对差值，要求对氯苯丝氨酸乙酯≤0.1％(溶液配制见实施例1)
65.系统适应性溶液
[0066][0067][0068]
样品溶液
[0069]
[0070]
缓冲盐加离子对试剂溶液的ph值为2.0时，进系统适应性溶液得到的色谱图见图1，ph为2.2时，进样品溶液得到的色谱图之一见图2。
[0071]
实施例3
[0072]
在选定色谱条件下：可变波长紫外检测器，检测波长：225nm；将流速改为：0.9ml/min～1.1ml/min；柱温：35℃；进样体积：10μl；色谱柱：ultimate xb-c18。
[0073]
流动相a：ph＝2.0磷酸二氢钾加四丁基氢氧化铵缓冲溶液，流动相b：色谱乙腈，以梯度比例洗脱。改变流速与不改变时分别以梯度比例洗脱，分别进系统适应性溶液1针，要求酸、醛、酯拖尾因子≤2.0，对氯苯丝氨酸乙酯与相邻峰分离度≥1.5；样品溶液2针，样品溶液检测结果的绝对差值，要求对氯苯丝氨酸乙酯≤0.1％(溶液配制见实施例1)。
[0074]
系统适应性溶液
[0075][0076]
样品溶液
[0077][0078]
其中，流速1.1ml/min时，进样品溶液得到的色谱图之一见图3。
[0079]
实施例4
[0080]
在选定色谱条件下：可变波长紫外检测器，检测波长：225nm；流速：1.0ml/min；柱温：30℃和40℃；进样体积：10μl；色谱柱：ultimate xb-c18。
[0081]
流动相a：ph＝2.0磷酸二氢钾加四丁基氢氧化铵缓冲溶液，流动相b：色谱乙腈，以梯度比例洗脱。改变柱温与不改变时分别以梯度比例洗脱，分别进系统适应性溶液1针，要求酸、醛、酯拖尾因子≤2.0，对氯苯丝氨酸乙酯与相邻峰分离度≥1.5；样品溶液2针，样品溶液检测结果的绝对差值，要求对氯苯丝氨酸乙酯≤0.1％(溶液配制见实施例1)。
[0082]
系统适应性溶液
[0083][0084]
样品溶液
[0085][0086]
其中，柱温为40℃时，进样品溶液得到的色谱图之一见图4。
[0087]
实施例5
[0088]
在选定色谱条件下：可变波长紫外检测器，检测波长：223nm和227nm；流速：1.0ml/min；柱温：35℃；进样体积：10μl；色谱柱：ultimate xb-c18。
[0089]
流动相a：ph＝2.0磷酸二氢钾加四丁基氢氧化铵缓冲溶液，流动相b：色谱乙腈，以梯度比例洗脱。改变检测波长与不改变时分别以梯度比例洗脱，分别进系统适应性溶液1针，要求酸、醛、酯拖尾因子≤2.0，对氯苯丝氨酸乙酯与相邻峰分离度≥1.5；样品溶液2针，样品溶液检测结果的绝对差值，要求对氯苯丝氨酸乙酯≤0.1％(溶液配制见实施例1)。
[0090]
系统适应性溶液
[0091][0092]
样品溶液
[0093][0094]
其中，波长为223nm时，进样品溶液得到的色谱图之一见图5。
[0095]
对比例1
[0096]
采用现有dl-苏式-对甲砜基苯丝氨酸乙酯纯度分析方法(色谱柱：hyper ods2 c18色谱柱，流动相v(乙腈)：v(水)＝7:3，检测器波长，uv254 nm；流速，1.0ml/min)，对dl-对氯苯丝氨酸乙酯进行检测，结果如下：
[0097]
样品溶液
[0098][0099]
由上述数据可以看出现有dl-苏式-对甲砜基苯丝氨酸乙酯纯度分析方法只能检测出酸和酯的含量，检测不出醛含量，且运行时间过长，故不适合dl-对氯苯丝氨酸乙酯制
备和质量控制过程中的监测。本专利的检测方法可以检测出已知杂质酸、醛以及一些未知杂质。其中，现有dl-苏式-对甲砜基苯丝氨酸乙酯纯度分析方法检测出的样品溶液图之一见图6。
[0100]
对比例2
[0101]
改变流动相的种类，选择用ph＝2.0hclo4水溶液代替缓冲盐加离子对试剂溶液作为流动相a，其它条件不变，对dl-对氯苯丝氨酸乙酯进行检测，结果如下：
[0102]
系统适应性溶液
[0103][0104]
样品溶液
[0105][0106]
由上述数据可以看出流动相a为ph＝2.0hclo4时，主成分酯的拖尾因子大于1.5，不符合方法学验证的要求，且醛的响应值很低。其中ph＝2.0hclo4流动相条件下的样品溶液色谱图见图7。
[0107]
实施例6
[0108]
本方法对dl-对氯苯丝氨酸乙酯含量的测定分析方法的学术性考察。
[0109]
专属性
[0110]
氧化降解
[0111]
称取60mg dl-对氯苯丝氨酸乙酯湿品于100ml容量瓶中，加4ml30％h2o2放置3h后，加2ml 1n盐酸溶解，加水定容，摇匀。同时做空白。
[0112]
检测数据
[0113]
氧化降解试验结果
[0114][0115]
氧化降解后的图谱之一见图8。
[0116]
酸降解
[0117]
称取60mg dl-对氯苯丝氨酸乙酯湿品于100ml容量瓶中，加4ml1mol/l hcl溶液64h后用1mol/l naoh调节ph至中性(ph≈6～7)，加水定容，摇匀。
[0118]
检测数据
[0119]
酸降解试验结果
[0120][0121]
酸降解后的图谱之一见图9。
[0122]
碱降解
[0123]
称取60mg dl-对氯苯丝氨酸乙酯湿品于100ml样品瓶中，加3.0ml1mol/l naoh溶液，30s后用0.1mol/l hcl溶液调节ph至中性(ph＝6～7)，加2ml1n盐酸,溶解，加水定容，摇匀。
[0124]
检测数据
[0125]
碱降解试验结果
[0126][0127]
碱降解后的图谱之一见图10。
[0128]
样品在强氧化性、酸性、碱性条件下有明显降解。
[0129]
线性关系考察
[0130]
准确称取dl-对氯苯丝氨酸乙酯标准品适量，分别配成浓度为loq、60％(0.36mg/ml)、80％(0.48mg/ml)、100％(0.6mg/ml)、120％(0.72mg/ml)、的浓度，各进3针，以图谱中主峰面积的平均值对被测溶液浓度进行线性回归；要求：相关系数r≥0.999，截距≤2.0％。
[0131]
dl-对氯苯丝氨酸乙酯
[0132][0133]
稳定性试验
[0134]
称取dl-对氯苯丝氨酸乙酯湿品60mg于100ml容量瓶中，加入1n盐酸2ml溶解加水定容，摇匀。作为稳定性溶液，稳定性溶液在配制完成后在室温条件下间隔0、2、4、6、8、10、16、20、24小时各进样品溶3针。要求：主含量其余各时间点测定结果与0小时测定结果的偏差≤2％，rsd≤1％，且较0小时溶液无杂质峰出现。
[0135]
[0136]
[0137][0138]
方法精密度
[0139]
选取同一批dl-对氯苯丝氨酸乙酯湿品，分别称取6份样品，每份溶液进2针；要求：主峰面积的rsd≤1％。
[0140][0141]
色谱系统精密度
[0142]
进系统适应性溶液6针；要求：主峰面积的rsd≤1％。
[0143]
[0144]
技术特征：1.一种测定dl-对氯苯丝氨酸乙酯含量的hplc方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将dl-对氯苯丝氨酸乙酯待测样品进行稀释，得到供试液；(2)采用高效液相色谱对步骤(1)的供试液进行分析，得到液相色谱数据；所述的高效液相色谱所用的流动相为流动相a与流动相b的混合溶液；所述的流动相a为缓冲盐与离子对试剂溶液；所述的流动相b为有机相；所述的缓冲盐与离子对试剂溶液配制方法如下：将无机盐、离子对试剂与超纯水混合，然后用酸调ph至2.0～6.0得到；(3)根据步骤(2)得到的液相色谱数据计算待测样品中dl-对氯苯丝氨酸乙酯的含量。2.根据权利要求1所述的测定dl-对氯苯丝氨酸乙酯含量的hplc方法，其特征在于，步骤(1)中，用0.8～1.2mol/l的稀盐酸或超纯水稀释待测样品。3.根据权利要求1所述的测定dl-对氯苯丝氨酸乙酯含量的hplc方法，其特征在于，步骤(2)中分析所用色谱柱为化学键合固定相色谱柱：ultimate xb-c18；检测器为可变波长检测器，检测波长为220～230nm；流动相流速为0.8～1.5ml/min。4.根据权利要求1所述的测定dl-对氯苯丝氨酸乙酯含量的hplc方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的无机盐选自钠、钾、铵的醋酸盐、磷酸盐、磷酸二氢盐、磷酸一氢盐、硫酸氢盐或硫酸盐，离子对试剂选自四丁基氢氧化铵、庚烷磺酸钠、四丁基溴化铵或十二烷基磺酸钠；所述的有机相选自乙腈、甲醇、四氢呋喃、乙醇、异丙醇、乙二醇、丙酮中的一种或多种。5.根据权利要求4所述的测定dl-对氯苯丝氨酸乙酯含量的hplc方法，其特征在于，所述的无机盐选自磷酸二氢钾，离子对试剂选自四丁基氢氧化铵，所述的有机相选自甲醇或乙腈。6.根据权利要求5所述的测定dl-对氯苯丝氨酸乙酯含量的hplc方法，其特征在于，所述的缓冲盐与离子对试剂溶液为10-100mm磷酸二氢钾与0.5-1.5mm四丁基氢氧化铵水溶液混合后，再用磷酸调ph值至1.8～2.2得到；所述的有机相为乙腈。7.根据权利要求6所述的测定dl-对氯苯丝氨酸乙酯含量的hplc方法，其特征在于，步骤(2)中，先分别配制浓度不同的流动相a和流动相b，然后采用梯度洗脱的方法进行分析。8.根据权利要求7所述的测定dl-对氯苯丝氨酸乙酯含量的hplc方法，步骤(2)中，梯度洗脱的流程如下：(1)0～7min，流动相a与流动相b的体积比为90～85：10～15；(2)7～12min，流动相a与流动相b的体积比为80～60：40～60；(3)12～17min，流动相a与流动相b的体积比为50～40：60～50；(4)17.1～27min，流动相a与流动相b的体积比为85～90：10～15。9.根据权利要求7所述的测定dl-对氯苯丝氨酸乙酯含量的hplc方法，梯度洗脱的流程如下：时间(min)07121717.127流动相a908040409090流动相b102060601010
10.根据权利要求1所述的测定dl-对氯苯丝氨酸乙酯含量的hplc方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的dl-对氯苯丝氨酸乙酯含量通过面积归一法计算得到。
技术总结本发明公开一种测定DL-对氯苯丝氨酸乙酯含量的HPLC方法。该方法是将DL-对氯苯丝氨酸乙酯用稀酸溶液配制成溶液，采用一种化学键合固定相色谱柱，以缓冲盐加离子对试剂，用酸调pH至0.8-12为缓冲盐溶液，缓冲盐加离子对试剂溶液与有机改性剂以适当比例进行梯度洗脱，然后在适当的检测波长、流速和柱温下检测，再根据谱图计算样品含量。采用本发明方法可使DL-对氯苯丝氨酸乙酯、对氯苯丝氨酸、对氯苯甲醛得到较好的分离，准确测出DL-对氯苯丝氨酸乙酯的含量，方法简单、可靠、迅速、灵敏度高、重现性和专属性好，为DL-对氯苯丝氨酸乙酯质量标准的制定建立基础。准的制定建立基础。
技术研发人员：李明明 武强 吴言琴 姜磊
受保护的技术使用者：普洛药业股份有限公司
技术研发日：2022.07.25
技术公布日：2022/11/1
