本发明属于生物传感器，具体涉及一种基于变构适配体和rca技术的荧光生物传感器及其应用。
背景技术：
1、金黄色葡萄球菌(s.aureus)是一种圆形的革兰氏阳性细菌，是最常见的食源性病原体之一，可通过产生肠道毒素或入侵生物体而引起严重的溴中毒和传染。大约30％至50％的人在鼻子、喉咙或皮肤上无症状地携带这种细菌。此外，金黄色葡萄球菌很容易在人与动物之间传播。鉴于金黄色葡萄球菌的容易传播和巨大的健康威胁，快速和准确地定量复杂基质中的金黄色葡萄球菌对于预防和诊断食源性疾病以及确保食品消费安全至关重要。
2、传统的平板培养和高灵敏度的聚合酶链反应(pcr)是鉴定实际样品中金黄色葡萄球菌的两种主要研究方法。然而，对于金黄色葡萄球菌的快速和现场分析，有一些限制使得培养方法和pcr都不是最理想的。培养方法的缺点是灵敏度低，耗时长，通常至少需要两天的时间。近年来，基于核酸的荧光生物传感器以其高灵敏度、高选择性、易于设计和合成等优点在生化分析中显示出良好的潜力。将等温扩增集成到基于核酸的荧光生物传感器中，可以显著提高其检测限，从而满足临床在大量生物背景材料中检测低浓度目标分析物的需求。特别是使用等温核酸扩增技术，如滚环扩增(rca)已被证明能够快速，灵敏和无标记地检测目标生物分析物。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种结合变构适体探针和rca的无标记荧光生物传感器及其应用检测方法，以实现对金黄色葡萄球菌的直接、快速和敏感检测。该方法被称为变构适体探针引发滚环扩增(aap-rca)试验。金黄色葡萄球菌特异性结合可诱导变构适体信标的结构变化，使引物暴露于挂锁探针。然后，引物可以触发rca反应，产生含有重复g-四链体长链序列，与染料tht结合后产生强大的荧光信号。
2、一种基于变构适配体和rca技术的荧光生物传感器，包括四部分：(1)依次连接的适体结构域、环结构域和挂锁探针引物结构域；(2)挂锁探针；(3)dna连接酶、dna聚合酶和dntps；(4)荧光染料。
3、所述的适体结构域用于与待检测目标物特异性结合；所述的环结构域用于连接适体结构域和挂锁探针引物结构域；所述的挂锁探针引物结构域用于与挂锁探针的引物结合位点域进行杂交启动rca反应；三个结构域在没有待检测目标物出现时形成发夹结构。
4、本发明采用的dna连接酶优选为t4 dna连接酶，dna聚合酶为phi29dna聚合酶；荧光染料为tht。
5、环结构域碱基长度5-7bp，挂锁探针引物结构域碱基长度17 -23bp；挂锁探针碱基长度68-74bp。
6、本发明还提供了所述的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
7、1)合成依次连接的适体结构域、环结构域和挂锁探针引物结构域；
8、2)合成挂锁探针。
9、本发明还提供了所述的生物传感器的应用方法，用于检测微生物、蛋白、核酸中的至少一种。
10、所述的微生物包括金黄色葡萄球菌。
11、进一步地，本发明用于包括：自来水、牛奶、生菜、橙汁样品中金黄色葡萄球菌的检测。
12、更进一步地，本发明用于非诊断和治疗目的检测。
13、与现有的病原体检测方法相比，aap-rca系统的独特之处在于:(1)基于变构适体探针的鉴定过程确保了分析的特异性；(2)使用rca进行信号放大使该系统在细菌检测中异常敏感，即使不需要细胞培养，也可以识别低至48cfu/ml的浓度；(3)无需细菌分离、核酸提取和清洗步骤，可直接、简单地定量复杂基质中的活病原体细胞。
14、本发明基于aap-rca分析的基本原理如图1所示。一个特定的aap包含三个结构域:一个挂锁探针引物结构域(绿色，a*)，一个环结构域(蓝色，b*)和一个适配体结构域负责识别目标病原体(红色，c*)。当目标病原体不存在时，aap呈现出一种具有发夹结构的非活性结构，其中挂锁探针引物结构域处于发夹结构的茎部，因此下游反应无法进入。在金黄色葡萄球菌的存在下，aap的适体结构域表现出特定的识别和结合能力，触发其发夹结构的展开，随后过渡到活性状态。因此，这种激活使得挂锁探针引物结构域能够有效地与新进入的挂锁探针的引物结合位点域进行杂交。然后在t4 dna连接酶、phi29 dna聚合酶和dntps的参与下启动rca反应，产生具有重复g4链体序列的长线性核酸序列。在与tht结合后，g4链体最终产生大大增加的荧光信号，用于测量金黄色葡萄球菌。
15、基于上述反应原理，本发明方法不仅仅适用于金黄色葡萄球菌的检测，还可以用于其他待测目标物的检测，只需要根据不同的待测目标物设计相应的特异性结合的核酸适体替换适体结构域即可。因此，本发明的生物传感器的应用前景较为广泛。
1.一种基于变构适配体和rca技术的荧光生物传感器，其特征在于，包括四部分：(1)依次连接的适体结构域、环结构域和挂锁探针引物结构域；(2)挂锁探针；(3)dna连接酶、dna聚合酶和dntps；(4)荧光染料。
2.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述的适体结构域用于与待检测目标物特异性结合；所述的环结构域用于连接适体结构域和挂锁探针引物结构域；所述的挂锁探针引物结构域用于与挂锁探针的引物结合位点域进行杂交启动rca反应；三个结构域在没有待检测目标物出现时形成发夹结构。
3.根据权利要求2所述的生物传感器，其特征在于，dna连接酶为t4 dna连接酶，dna聚合酶为phi29 dna聚合酶；荧光染料为tht。
4.根据权利要求1或2所述的生物传感器，其特征在于，环结构域碱基长度5-7bp，挂锁探针引物结构域碱基长度17-23bp；挂锁探针碱基长度68-74bp。
5.权利要求1-4任一项所述的生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.权利要求1-4任一项所述的生物传感器的应用方法，其特征在于，用于检测微生物、蛋白、核酸中的至少一种。
7.根据权利要求6所述的应用方法，其特征在于，所述的微生物包括金黄色葡萄球菌。
8.根据权利要求6或7所述的应用方法，其特征在于，用于包括：自来水、牛奶、生菜、橙汁样品中金黄色葡萄球菌的检测。
9.根据权利要求6或7所述的应用方法，其特征在于，用于非诊断和治疗目的检测。
